基因工程基本原理及技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-26 09:58 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 外包裝 ,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。 如 cosmid pHC79 4．病毒載體 常用的動(dòng)物病毒表達(dá)載體可分為兩大類： 整合型（ integrated）載體 ．即外源基因通過(guò)這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。這類載體的代表是 SV40－ PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒－逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 pLPGHL、 pMSV 等。 游離型 (transient)或稱病毒顆粒型載體，這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。 5． 克隆載體 (cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的 基因擴(kuò)增 的載體 。 一般具有較低的分子量 、 較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子 。 主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒 、 噬菌體及真核生物病毒的 DNA重組構(gòu)建 。常用載體 pUC18 pUC 19. 6． 表達(dá)載體 (expression vector) 使 目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá) 的載體 。 可將重組體 DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞 ， 使所載荷的目的基因能夠復(fù)制 、 轉(zhuǎn)錄和翻譯 。 7． 穿梭載體 (shuttle vector) 又稱 雙功能載體 (bifunctional vector)。 能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來(lái)穿梭的載體 . 其可同時(shí)具有 細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn) 和 真核生物可識(shí)別的病毒復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ ARS） ， 它即能在 原核細(xì)胞中擴(kuò)增 又能在 真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá) 。 主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移 ， 通常是將載體和待克隆的真核生物 DNA片段先在細(xì)菌中克隆 ， 再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá) ， 并可提高外源基因的表達(dá)效 率 。如 pKSV一 pJDB219載體等 。 ori P o LacZ kmram2 （三） .限制性核酸內(nèi)切酶 限制酶是一種必不可少的工具酶，是進(jìn)行DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀”或“分子手術(shù)刀”之稱。 概念 ：限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease ) 是指能專一地識(shí)別 DNA分子上特定的堿基序列并將 DNA切斷的內(nèi)切酶。 識(shí)別序列的特點(diǎn) (1)專一； (2)常由 4— 6個(gè)堿基組成； (3)具有回文序列 (palindromic sequence) 切口類型 ： (1)形成粘末端 (cohesive end)： DNA分子末端的單鏈片段能與其他 DNA單鏈片段互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈者，這兩個(gè) DNA分子末端單鏈片段即為粘末端：如BamHⅠ 5` G↓GATCC3` 3` CCTAG↑G5` ↓ 5`NNNNNNG GATCCNNN3` 3`NNNNNNCCTAG GNNN5` （ 2） 形成平末端 ； SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC 酶切反應(yīng)條件： （ 1） 需要合適的底物 ：底物 （ DNA） 純度要高 .不能含有 RNA和蛋白質(zhì) 。也不能含有過(guò)高的 EDTA。 更不能含有酚 、 氯仿 、 乙醇 、 SDS和其他有機(jī)試劑 。 DNA 的濃度 不宜過(guò)高 ， 高濃度的 DNA 會(huì)使溶液的粘待度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底 。 常為 50ul內(nèi)含 1ug DNA）（ 2） 合適的酶量 ：酶和底物比例 2~10u/ug DNA,避免使用過(guò)高的酶濃度 （ 3） 合適的反應(yīng)介質(zhì) （ 緩沖體系 ） ：反應(yīng)均以 TrisHcl作緩沖液； PH值多在 ~；反應(yīng)需要 Mg2+激活；多數(shù)酶反應(yīng)尚需要 2— 巰基乙醇 （ BME） 或二硫基蘇糖醇 （ DTT） 的存在 。 此外 ， 許多酶反應(yīng)還需要 NaCl ， 但不同的酶對(duì) NaCl的需要量各有差別 。 （ 4） 溫度和作用時(shí)間 等：大多數(shù)限制酶的反應(yīng)溫度為 370C，個(gè)別酶則需要 500C、 600C或650C的高溫。一般在適宜的緩沖液和溫度條件下，每微克 DNA用 1~5單位的酶，保溫 1~2小時(shí)。 (四 ) DNA重組 (連接 )和基因轉(zhuǎn)移 DNA重組 （ DNA rebination） 不同的 DNA片段之間的連接需要另一種工具酶 連接酶 的幫助 . 目的 DNA酶切片斷＋載體 DNA酶切片斷 ＋ T4DNA ligase? DNA重組體 . T4DN 連接酶 (T4DN ligase):是從感染 T4噬菌體的 E． coli中
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