【文章內(nèi)容簡介】 7 、 JM10TG XL1Blue 2 質(zhì)粒 M13 雜交載體 ：含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質(zhì)粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體，集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體。特點：能像M13DNA 那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞，能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制，裝載量比常規(guī)的 M13mp 系列要大很多（ 10 kb），通過克隆雙鏈 DNA 能獲得同等長度的單一單鏈 DNA。 2 重要的噬菌粒載體： pUC118 / 119： pUC118 pUC18 + M13 間隔區(qū) IG； pUC119 pUC19 + M13 間隔區(qū) IG 2 pEMBL8 噬菌粒：在 pUC8 中插入了一個 1300bp 的 M13 基因組。含有將雙鏈分子轉(zhuǎn)化為單鏈分子的酶識別位點?？梢砸再|(zhì)粒的形式復制，也可以包裝，以噬菌體的方式復制?？煽寺?10kb 的 DNA 片段。 2 P1 噬菌體基本結(jié)構(gòu)與特征：（ 1） 基因組長 88 kb, 在噬菌體顆粒中的 DNA 長 100 kb, 呈線狀 ,兩端約有 12%的多余 DNA。；（ 2）基因組含 loxP 重組位點，由重組酶 Cre 催化。在 rec+大腸桿菌中，末端冗余序列同源重組導致基因組環(huán)化；而在 rec大腸桿菌中只有含兩個 loxP位點的 P1 噬菌體 DNA 才能環(huán)化，啟動復制；（ 3） 可以低拷貝質(zhì)粒形式存在于細菌細胞中（溶原狀態(tài)） , 又可以烈性噬菌體形式進行復制（裂解生長）；（ 4） P1 噬菌體包裝原理 : 漸進滿頭機制；底物 :：滾環(huán)復制過程形成的頭尾相連多聯(lián)體。包裝過程 : ①始于一個長 162bp的 P1 pac 位點，識別和切割此位點的是 P1 編碼的 pacase，切出的 pac 一端進入預制頭部，當其頭部充滿 DNA 后， DNA 再次被切。第二次切割是隨機的，無特異性 DNA 序列。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個 pac 位點開始的。 P1 頭部可容 110Kb。② pac 位點 : 一端含 4 個六聚體 (5’ TGATCA/G 3’ )，另一端則有三個，中間區(qū)域長 90 bp， pacase 切點位于靠近 90 bp 區(qū)的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點 (dam→ GATC), pacase 只作用甲基化的 pac 位點。 5’ ( TGAmTCA/G )6N90 ( TGAmTCA/G ) 33’ 2 P1 載體優(yōu)點： ①可克隆較大插入片段 ,，可插入 95Kb 外源 DNA，二倍于 cos 質(zhì)粒載體； ② 較高的轉(zhuǎn)化頻率 , 1~2μ g 載體 + 2~4μ g 外源 DNA→ 105轉(zhuǎn)化子 ③ 與 YAC 載體相比，它易于產(chǎn)生多拷貝的基因組片段 。 易于獲得大量特定的克隆 DNA。 克隆過程更可靠 。 克隆片段易于進行次克隆 2 P1 噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的示意圖： pAd10 sacBⅡ — ScaI+BamHI — 長臂 + 短臂 —加入外源 — DNA 片段 — 重組 DNA 分子 — 離體包裝 — 感染宿主細胞 2 宿主菌： NS3529 菌株基因型 recA， lacⅠ q， mcrABC， mrr； recA：防止插入 DNA片段內(nèi)的同源重組，以免發(fā)生重排； lacⅠ q ： 抑制 P1 裂解復制子 的激活 , 使 P1 質(zhì)粒復制子在細胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源 DNA 分子重排； mcr 和 mrr：抑制富含 GpMeC或 ApMeC 插入片段的選擇性丟失。 第二章：工具酶 核酸：核酸水解酶類（核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶）；核酸合成酶類（ DNA 聚合酶、 RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄、 DNA 連接酶）；核酸修飾酶類（甲基化酶、核苷酸激酶、磷酸酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶）。 限制性核酸內(nèi)切酶概念：是一類能夠識別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列（ 4—8bp），并由此處切割 DNA 雙鏈的脫氧核酸內(nèi)切酶。 限制性核酸內(nèi)切酶：來源：原核生物； 性質(zhì)：內(nèi)切酶（即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶）；功能：自我保護作用（降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。細菌的限制和修飾系統(tǒng)（ R/M 體系））。 限制性核酸內(nèi)切酶：（ 1）限制：限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源 DNA 切成小片斷。（ 2）修飾：細菌自身的 DNA 堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。① Dam 甲基化酶： GATC 腺嘌呤 N6 位置引入甲基；② Dcm 甲基化酶： CCAGG或 CCTGG 序列在第二個 C 上 C5 位置上引入甲基。 限制性內(nèi)切酶的命名：按酶的來源的屬、種名而定， 取屬名的第一個字母與種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母作主語表示，如有株名，再加上一個字母；其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。 限制性內(nèi)切酶的類型： I 型限制性內(nèi)切酶； II 類限制性內(nèi)切酶； III 類限制性內(nèi)切酶。 I 型限制性內(nèi)切酶：（ 1）識別位點序列：未甲基化修飾的特異序列。（ 2）切割位點：在距離特異性識別位點約 1000— 1500 bp 處隨機切開一條單鏈。（ 3）作用機理：是三亞基雙功能酶，限制酶切與甲基化互斥，需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 三亞基雙功能酶：酶活性取決于識別序列甲 基化狀態(tài)。兩條鏈均甲基化：既不限制也不修飾；兩條鏈均未甲基化：限制即酶切；兩條鏈半甲基化：修飾未甲基化的鏈。 III 類限制性內(nèi)切酶：在識別位點下游 2426bp 切割 DNA，但反應需要 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。二亞基雙功能酶 RMS 限制酶切與甲基化反應同時競爭。 10:、 II 類限制性內(nèi)切酶：分離的第一個酶是 Hind Ⅱ。（ 1）識別位點序列：未甲基化修飾的雙鏈 DNA 上的特殊靶序列（長度，堿基的組成，多數(shù)是回文序列）與 DNA 的來源無關。① 大多數(shù)為回文對稱 /旋轉(zhuǎn)對稱，② 非對稱，③ 多識 別序列 (簡并序列 )，④ 間斷對稱。 （ 2） 切割位點：酶切的結(jié)果：切開雙鏈 DNA 形成粘性末端，平齊末端。（ 3）粘性末端：含有幾個核苷酸單鏈的末端。① 5’端凸出，即靠近 5’端切割（如 EcoR I 切點），② 3’端凸出，即靠近 3’端切割（如 Pst I 切點）。（ 4）粘性末端的意義。（ 5）同裂酶和同位酶。（ 6）同尾酶。（ 7）Ⅱ s 型限制性內(nèi)切酶。（ 8）歸位內(nèi)切酶。（ 9）切口酶 1 粘性末端的意義：連接便利 ： i）不同的 DNA 雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。 ii）同一個 DNA 分子內(nèi)連 接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。 1 同裂酶和同位酶：識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。① 同裂酶：同序同切酶（識別位點和切點完全相同）；② 同位酶：同序異切（識別位點相同，但切點不同）；③“同功多位” 許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。 1 同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。 1 Ⅱ s 型限制性內(nèi)切酶：漂移切割：在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割 DNA雙鏈。 1 歸位內(nèi)切酶：是雙鏈 DNA 核酸酶，能識別較 長的非回文序列（ 1240 bp），其編碼序列位于內(nèi)含子或內(nèi)含肽中。歸位內(nèi)切酶的命名延用了一般內(nèi)切酶的命名原則。內(nèi)含子編碼的歸位內(nèi)切酶加前綴“ I”；內(nèi)含肽編碼的歸位內(nèi)切酶加前綴“ PI”。 1 切口酶：有些限制酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，稱之切口酶。 1 三類限制性內(nèi)切酶對比： I 型限制性內(nèi)切酶（酶分子：三亞基雙功能酶；識別位點：二分非對稱；切割位點：無特異性至少在識別位點外 1000bp；限制反應與甲基化反應：互斥；限制反應需要 ATP）。 II 類限制性內(nèi)切酶（酶分子：內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起；識別 位點： 46bp 大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)；切割位點：在識別位點中或靠近識別位點；限制反應與甲基化反應：分開的反應；限制反應不需要 ATP）。 III 類限制性內(nèi)切酶（酶分子：二亞基雙功能酶；識別位點： 57bp 非對稱；切割位點：在識別位點下游 2426bp；限制反應與甲基化反應：同時競爭；限制反應需要 ATP）。 1 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：① DNA 的純度：（純化 DNA，加大酶的用量，延長保溫時間，擴大反應體積（ 20μι）；② 緩沖液：是影響限制酶活性的重要因素（ MgClNaCl/KCl：提供 Mg2+和離子 強度； TrisHCl：維持 pH； 二硫蘇糖醇（ DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白 BSA 等：有助于酶的穩(wěn)定）③溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同，大多數(shù)是 37 oC，少數(shù)要求 4065 oC。 1 限制酶的酶活性：限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、 pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。所以一般使用專一的反應緩沖液。 星號（ *）活性：如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（ *）活性。引起星星活性的因素 ：① 高濃度甘油（ 5%） ② 酶過量（ 100U/μ g）酶與底物DNA 比例過高③ 低離子強度（ 25mM） ④ 高 pH () ⑤ 有機溶劑 ⑥ 用其它二價陽離子代替 Mg++。抑制星星活性的條件：① 減少酶的用量，避免過量酶切 ,減少甘油濃度 ② 保證反應體系中無有機溶劑或乙醇 ③ 提高離子強度到 100～ 150mM (如果不會抑制的話 ) ④ 降低反應 pH 至 ⑤ 使用 Mg++作為二價陽離子 2 位點偏愛：某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割。 2 DNA 的甲基化程度： dam 甲基化酶（修飾 GATC 中的 A）； dcm 甲基化酶（修飾 CCA/TGG的 C）。 2 酶活性單位 (unit, U): 在建議使用的緩沖液及溫度下，在 20μ l 反應液中反應 1 小時，使1μ g DNA 完全消化所需的酶量。 2 內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式：①完全酶切：內(nèi)切酶在 DNA 上的所有識別位點都被切開；②部分酶切：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或 2 減少酶的用量可達到局部消化的目的。③單酶切： 20μ l 反應體系： 13μ l 雙蒸水 2μι10x buffer 、 4μ l DNA、 1μ l 內(nèi)切酶；離心 2 秒混勻，最適反應溫度 1～ 3 小時， 65℃保溫15 分。④雙酶切： a. 選用都合適的 Buffer or KGB ； b. 不可替代：先低鹽 buffer，后加適量NaCl 和第二種酶 ； c. 先低溫后高溫（可純化或不純化）；注意事項 a. 取少量酶 (方法 or 稀釋 ) b. 最后加酶、盡快操作 c. 減少反應體積 d. 反應時間的延長 e. 分裝（對于多個反應）。 2 限制酶酶切反應的終止：大多數(shù)酶可用 65 oC 溫育 5 分鐘失活。 或用乙醇沉淀 DNA。 2 限制性核酸內(nèi)切酶的應用：重組 DNA 前的切割；酶切受體 DNA；構(gòu)建新克隆載體；構(gòu)建 DNA 物理圖譜；制備 DNA 探針； DNA 分子雜交； 亞克隆以用作序列分析；基因定位， DNA同源性研究。 2 DNA 分子的限制性圖譜： DNA 分子上每一種內(nèi)切酶識別序列的分布圖 2 RFLP ：技術的原理是檢測 DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小。①限制性內(nèi)切酶酶切后；②電泳分離 DNA 片段；③轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針雜交，⑤分析陽性條帶 兩種 DNA 連接酶：（ 1）大腸桿菌連接酶：只能連接粘性末端。（ 2） T4 噬菌體的連接酶：不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。 3 DNA 連接酶的連接條件：（ 1）必須是兩條雙鏈 DNA。（ 2） DNA3’端有游離的 OH， 5’端有一個磷酸基團（ P）； 3‘ OH 對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出 AMP。 （ 3）需要能量：動物或噬菌體中： ATP ，大腸桿菌中： NAD+ 3 DNA 連接酶連接反應的溫度：最佳溫度：連接酶反應的最佳溫度是 37 度。實用溫度 ：但在 37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定，所以一般采用 4~16 度。 3 影響 DNA 連接酶連接反應的因素：插入片段與載體的濃度比例（ 10~20 倍，增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象）；反應溫度 （ ℃，一般 14~16℃）。 3 熱穩(wěn)定的連接酶：能在高溫下催 化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 3 連接酶的應用：寡核苷酸連接測定（ OLA），連接酶鏈式反應（ LCR） 3 DNA 片段的連接策略：黏性末端、平末端、黏性末端＋平末端 3 互補粘性末端的連接：①同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割；②兩種同尾酶切割。 3 不同粘性末端修飾成平末端后進行連接：核酸外切酶的作用方式是從雙鏈 DNA 分子的一端（ 3′ 端或 5′ 端）單鏈部分開始，逐個水解切除核苷酸，使黏性末端成為平末端。 3 平端 DNA 片段的連接：多種情況出現(xiàn)平末端；