基因工程和基因組學(xué)(編輯修改稿)
2024-10-08 20:50 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 全部缺失即卸甲（ disam）后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的 TDNA仍可將 RB至LB內(nèi)的序列 轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。 (3)vir的毒性基因是 TDNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制 TDNA轉(zhuǎn)移。 Ti質(zhì)粒的特點(diǎn) 原核生物主要載體用途小結(jié) ： 載體 用途 質(zhì)粒 λ cosmid M13 YAC 大片段 DNA克隆 — + + — + 基因文庫(kù)構(gòu)建 — + + — + cDNA文庫(kù)構(gòu)建 + + — — — 序列分析 + — — + — 單鏈探針 — — — + — 工程菌 + — — — — (一 )從基因庫(kù)中分離基因 1構(gòu)建基因庫(kù) (1)核基因庫(kù)。 核基因庫(kù) (GENOMIC library 或 genomic bank)是將某一生物的全部基因組 DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。 通常的 方法 是，盡量提取大分子量的核 DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度 (大于 15kb)的 DNA片段，與適宜的載體 (如 EMBL) 連接構(gòu)成重組 DNA分子，根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。 四、基因的分離與鑒定 獲取目的基因及鑒定基因產(chǎn)物 提取基因組 DNA 限制酶酶切基因組 DNA 轉(zhuǎn)移入大腸桿菌進(jìn)行克隆 酶切 DNA片段與質(zhì)粒載體連接 (2)染色體基因庫(kù)。將基因組的一部分 (如一根染色體 )用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)， （ 3)cDNA庫(kù)： cDNA庫(kù)是以 mRNA為模板 ,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) DNA(plementary DNA,cDNA)構(gòu)建的基因庫(kù) 。 合成 方法 ：利用一段 polyT為引物 ，與 polyA互補(bǔ)配對(duì)，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，用 polyT引物引導(dǎo)合成一條互補(bǔ) DNA，形成 RNADNA雜合雙鏈 。第一條互補(bǔ) DNA鏈形成時(shí)，通常在其 339。末端回轉(zhuǎn)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作為引物引導(dǎo)合成第二條鏈 DNA，再用 Sl核酸酶將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈部分降解，就得到了雙鏈 DNA。也可在形成 RNADNA雜合鏈后，用 RNA H酶 (Rnase H)在 mRNA鏈上產(chǎn)生一些缺刻 (nick)，形成很多 RNA分子小片段，在 DNA聚合酶的作用下，以這些 RNA小片段為引物引導(dǎo)合成第二條 DNA鏈。 從細(xì)胞中分離出 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA 與載體連接成重組 DNA 轉(zhuǎn)移入大腸桿菌進(jìn)行克隆 合成雙鏈 DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA聚合酶 利用一段核苷酸序列 (DNA， cDNA或寡聚核苷酸 )作探針 (probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，篩選基因庫(kù)。 若篩選入噬菌體構(gòu)建的庫(kù)，可利用 菌斑雜交法 ：將經(jīng)重組噬菌體 (來(lái)自構(gòu)建的基因庫(kù) )感染宿主細(xì)菌細(xì)胞，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑。一個(gè)噬菌斑就是一個(gè)克隆。再將培養(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜或尼龍膜上變性，然后用標(biāo)記的探針 (也變性成單鏈 )與膜上的噬菌體 DNA雜交，將雜交膜用 X光片放射自顯影，檢測(cè)雜交信號(hào)。 凡是與探針雜交的噬菌斑即為陽(yáng)性克隆，在 X光片上有雜交信號(hào) (黑點(diǎn) )。根據(jù)雜交信號(hào)在膜上的相對(duì)位置，定位找出培養(yǎng)皿中所對(duì)應(yīng)的噬菌斑，挑出并培養(yǎng)陽(yáng)性噬菌斑， 2篩選基因庫(kù) 首先將陽(yáng)性克隆 DNA酶切；然后將酶切的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，最后做出圖譜。 Page227圖 陽(yáng)性克隆的分析與鑒定 ： (1)限制性酶圖譜。 泳 Southern 雜交分析 (Southern blotting) 是基因工程中常用的方法， 1975年由英國(guó)的 Southern發(fā)明。先是將 DNA用限制性酶酶切，然后將酶切的 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過(guò)變性處理后，將凝膠上的 DNA轉(zhuǎn)移到膜上，再用經(jīng)過(guò)放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記的 DNA探針與膜上的 DNA片段雜交，洗去膜上非特異性結(jié)合的探針后，用 X光片放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，放射自顯影后就會(huì)檢測(cè)到雜交帶信號(hào)。 (2)核酸分子雜交。 Sanger于 1977年發(fā)明的 雙脫氧核苷酸鏈終止法 ：將序列反應(yīng)分為 A、 C、 G和 T4管，每管中含有變性的 DNA模板、DNA聚合酶、標(biāo)記的引物、 4種脫氧核苷酸，再摻入一種一定比例的雙脫氧核苷酸 。在 DNA合成過(guò)程中，雙脫氧核苷酸與互補(bǔ)序列配對(duì)被整合到正在延長(zhǎng)的 DNA鏈中，在不同DNA鏈上隨機(jī)地整合在不同位置。由于雙脫氧核苷酸在第三位沒有游離的羥基 (0H)，無(wú)法再連接另一個(gè)核苷酸，導(dǎo)致 DNA鏈合成在這里終止。結(jié)果每一個(gè)反應(yīng)管中都合成一系列不同大小的 DNA分子。將 4個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物并排點(diǎn)在聚丙烯酰胺凝膠上的 4個(gè)孔中，電泳后每個(gè)孔中形成一條梯狀DNA帶， 從底部往上閱讀，即是 539。到 339。端的序列 。 (3)核酸序列測(cè)定。 O 堿基 C P OH H 1 2 3 4 5 O 堿基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH 脫氧核苷酸的連接 DNA測(cè)序 O 堿基 C P O H 1 2 3 4 5 O 堿基 C P OH H 1 2 3 4 5 H2O 脫氧核苷酸的連接 O 堿基 C P H H 1 2 3 4 5 O 堿基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH X 雙脫氧核苷酸… ? 四套反應(yīng)體系 1dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP 2dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP 3dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP 4dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP ATGCGGTACCAT 5’ 3’ 測(cè)序模板 5’ TA 5’ TACGCCA 5’ TACGCCATGGTA C C C 第一套反應(yīng) 第二套反應(yīng) 5’ 5’ 5’ A C G T A T G G T A C C G C A T DNA自動(dòng)測(cè)序 分析核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，同源性比較是常用的方法之一。 另一種方法是分析核酸序列的閱讀框架。 (4)核酸序列分析。 (二 )聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain
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