【正文】 如由小 F質(zhì)粒構(gòu)建的載體pBeloBAC11全長(zhǎng) ,僅帶有自我復(fù)制，控制拷貝數(shù) (repE)及質(zhì)粒分配 (parE,parA,parB)所必須的最少序列 .這些基因均來(lái)自 F因子 .BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因以及多克隆位點(diǎn) .在 pBeloBAC11中 ,多克隆位點(diǎn) lacZ基因內(nèi) ,因此可采用選擇 pUC18陽(yáng)性重組子的方法 ,即 α 互補(bǔ)顯色法選擇陽(yáng)性BAC重組子 . ㈤ 細(xì)菌人工染色體 (BAC) 根據(jù)穿梭質(zhì)粒 Yep的一些特點(diǎn)構(gòu)建而成 . 1996年酵母菌基因組全部序列已經(jīng)測(cè)定 ,為分析 YAC克隆提供了直接依據(jù) .將來(lái)自 YAC克隆的序列與酵母菌基因組序列比較 ,即可以完全排除重組 YAC載體來(lái)自酵母菌 DNA的可能性 . 同 Yep載體一樣， YAC也具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。根瘤土壤桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤。 [七 ]Ti質(zhì)粒 及其衍生載體 (1) Ti質(zhì)粒具有 5個(gè)主要功能區(qū)域 。 (3)vir的毒性基因是 TDNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制 TDNA轉(zhuǎn)移。 通常的 方法 是，盡量提取大分子量的核 DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度 (大于 15kb)的 DNA片段，與適宜的載體 (如 EMBL) 連接構(gòu)成重組 DNA分子，根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。第一條互補(bǔ) DNA鏈形成時(shí)，通常在其 339。 若篩選入噬菌體構(gòu)建的庫(kù)，可利用 菌斑雜交法 ：將經(jīng)重組噬菌體 (來(lái)自構(gòu)建的基因庫(kù) )感染宿主細(xì)菌細(xì)胞，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑。根據(jù)雜交信號(hào)在膜上的相對(duì)位置，定位找出培養(yǎng)皿中所對(duì)應(yīng)的噬菌斑，挑出并培養(yǎng)陽(yáng)性噬菌斑， 2先是將 DNA用限制性酶酶切，然后將酶切的 DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過(guò)變性處理后，將凝膠上的 DNA轉(zhuǎn)移到膜上，再用經(jīng)過(guò)放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記的 DNA探針與膜上的 DNA片段雜交，洗去膜上非特異性結(jié)合的探針后，用 X光片放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。在 DNA合成過(guò)程中，雙脫氧核苷酸與互補(bǔ)序列配對(duì)被整合到正在延長(zhǎng)的 DNA鏈中，在不同DNA鏈上隨機(jī)地整合在不同位置。到 339。 另一種方法是分析核酸序列的閱讀框架。 1延伸 在引物的引導(dǎo)及 Tap酶的作用下，于 72oC記 下合成模板 DNA的互補(bǔ)鏈。再用兩個(gè) PCR引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增出 DNA片段。再將純化的 A鏈和 B鏈混合后，經(jīng)二硫鍵連接成為完整的胰島素。基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù) :通過(guò)高壓氣體等動(dòng)力，高速發(fā)射包裹有重組 DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導(dǎo)人受體細(xì)胞，并整合到染色體上的方法。例如，利用轉(zhuǎn)基因羊大量表達(dá)人類(lèi)的抗胰蛋白酶。 (四 )遺傳疾病診斷 (1)RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多型性 )法 限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別并切割特異核苷酸序列。 RFLP： restriction fragment length polymorphism, 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。圖左、右兩側(cè)的箭頭表示子女 DNA指紋圖中分別與其父、母的 DNA指紋圖譜中相對(duì)應(yīng)的分子雜交條帶 ＋ F1 A C B 例 2：系統(tǒng)發(fā)育的 RFLP分析 A植物的 DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜 13 5 6 2 8 如果植物 A與祖先植物種相比變化很小，假設(shè)它發(fā)生了兩個(gè)突變，一個(gè)突變是形成植物 B的過(guò)程中產(chǎn)生了一個(gè) 9kp和 4kp的片段；另一個(gè)突變是形成植物 C的過(guò)程中，一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)消失，產(chǎn)生一個(gè)11kp的內(nèi)切酶片段，而 5kp和 6kp兩條帶消失。從白細(xì)胞中提取 DNA后特異引物進(jìn)行 PCR，再將 PCR產(chǎn)物點(diǎn)到膜上，用 β 球蛋白基因作探針雜交，據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)度直接判斷基因型 .當(dāng)用正常寡聚核苷酸進(jìn)行 PCR分析時(shí)，根據(jù)雜交信號(hào)推知 :純合 (β Aβ A)基因型產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào) (深色 )，雜合 (β Aβ S)基因型產(chǎn)生較弱信號(hào) (較淺 ),而突變的隱性純合 (β Sβ S )基因的序列不能與 AS0結(jié)合，故沒(méi)有信號(hào)。1991年 7月，我國(guó)開(kāi)始進(jìn)行 HEMB（血友病 B，凝血因子 IX突變）的基因治療。其中 68%是治療腫瘤的， 19%是治療遺傳病的， 12%治療傳染性疾病等 。 90年由美國(guó) Affymetrix公司開(kāi)始研究 ,96年誕生第一塊DNA芯片 . DNA芯片技術(shù)是在面積不大 (如 2cm2)的基片表面分成不同小格，有序地點(diǎn)陣排列一系列固定于一定位置的、可尋址的探針，再將待分析的 DNA分子標(biāo)記 ，變性成單鏈后與芯片進(jìn)行分子雜交，與芯片上序列相同的核苷酸將與其雜交，與芯片上序列不同的序列就會(huì)被洗掉，然后用高精度的激光掃描儀記錄分子雜交的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析、綜合成可讀的信息 .只需一次實(shí)驗(yàn) ,便能將成千上萬(wàn) 的基因圖譜記錄下來(lái) . (六 )DNA芯片 DNA芯片 基因組學(xué) （ genomics） :研究生物體全基因組(genome) 的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化，弄清基因組包含的遺傳物質(zhì)的全部信息及相互關(guān)系的科學(xué)。 ?后基因組學(xué) （ postgenomics）：在完成基因組圖譜構(gòu)建以及全部序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究全基因組的 功能、基因之間的相互關(guān)系和調(diào)控機(jī)制為主要內(nèi)容的學(xué)科。 附、基因的概念與發(fā)展 ? Mendel—— 遺傳因子 ? 丹麥 Johanssen—— 基因 ? ,Man等提出了基因的染色體理論，即染色體是 基因的載體，基因是三合一體，即 基因既是一個(gè)功能單 位，也是一個(gè)突變單位和一個(gè)交換單位 。 基因是可分的，功能上是有差別的 結(jié)構(gòu)基因 — 決定合成某種蛋白質(zhì) 調(diào)節(jié)基因 — 編碼阻遏或激活結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)基因 無(wú)翻譯產(chǎn)物的基因 （ 1944年 Beadle研究脈胞菌突變 —— 提出 一基因一酶學(xué)說(shuō)； 后來(lái)研究血紅蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)可由不同肽鏈組成，而突變只影響一條肽鏈 —— 提出了 一基因一多肽學(xué)說(shuō)） ? —— 斷裂基因，重疊基因，跳躍基因 比較 DNA序列和成熟 mRNA—— 內(nèi)含子和外顯子 ?① 基因是實(shí)體，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是 DNA（或 RNA）； ?②基因是具有一定遺傳效應(yīng)的 DNA分子中的特定核苷酸序列； ?③基因是遺傳信息傳遞和性狀分化發(fā)育的依據(jù) ?④基因是可分的 按原初功能（基因的產(chǎn)物）基因可分為 編碼蛋白質(zhì)的基因 （結(jié)構(gòu)基因 +調(diào)節(jié)基因） 無(wú)翻譯產(chǎn)物的基