【正文】 段：酶切＋修飾＋連接 3 pBR322 載體長 4362 bp，它有一個來自 ColE1/ pMB1 的復(fù)制起點 (ori)，這個復(fù)制起點可使 pBR322 在大腸桿菌中的拷貝數(shù)達(dá)到 20 個。其占據(jù)質(zhì)粒的三分之一 (～ 33 kb)，稱為轉(zhuǎn)移區(qū)，包括編碼 F 性菌毛、穩(wěn)定接合配對、轉(zhuǎn)移的起始和調(diào)節(jié)等，總共約 40 個基 因。 2 在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥 (稀釋 )掉。 2 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性：（ 1）分子?。?1～ 200 kb，多數(shù) 10kb；（ 2）編碼基因少： 2～ 3個中等大小的蛋白質(zhì) ；（ 3）環(huán)形狀：絕大多數(shù)是雙鏈環(huán)狀 DNA；（ 4）質(zhì)粒 的空間構(gòu)型：① 共價閉合環(huán)狀 DNA，呈超螺旋（ SCDNA）；② 開環(huán) DNA（ OCDNA）；③ 線形 DNA（ IDNA）；（ 5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率： scDNA 最快、 l DNA 次之、 ocDNA 最慢。 質(zhì)粒：是一類特別亞細(xì)胞有機體。 1 人工染色體載體：指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。 1 病毒型載體：所含的復(fù) 制起點是來自病毒 DNA。 1 載體分類：按照載體的 復(fù)制子來源劃分 ：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、混合型載體、人工染色體載體。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì) 胞：轉(zhuǎn)化細(xì)胞有了新的表型，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞仍保持原有的表型。 克隆位點一定是一個限制酶切位點，而且必須是由 6 個核苷酸或 6 個核苷酸以上的序列 組成的限制酶識別位點。 載體的功能及特征：運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的擴增或表達(dá)提供必要的條件。）③基因工程的迅速發(fā)展階段（發(fā)展了一系列新的基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建各種克隆載體，培育出許多轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)了許多生物藥品。 基因克?。?DNA 分子克?。涸隗w外重新組合 DNA 分子的實驗過程中，是通過能夠獨立自主復(fù)制的載體分子質(zhì)?；蚴删w為媒介的，將外源 DNA 或外源基因引入到寄主細(xì)胞進行增殖，從而獲得大量相同的重組 DNA 分子，或者外源基因表達(dá)獲得大量的蛋白質(zhì)。 生物原料：指生物體的某一部分或生物生長過程產(chǎn)生的能利用的物質(zhì)，如淀粉、糖蜜、纖維素、生物堿、乙醇等有機物，也包括一些無機化學(xué)品，甚至某些礦石。第一章 生物技術(shù)：是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。 基因工程：指在基因水平上，采用與 工程設(shè)計十分類似的方法，按照人類的需要進行設(shè)計，然后按設(shè)計方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系。 基因工程理論依據(jù)：不同生物的基因 有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，遺傳密碼是通用的，基因是可切割的，基因是可以轉(zhuǎn)移重組的，基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。） 1973 年，基因工程誕生元年 1 轉(zhuǎn)基因動物 體內(nèi)帶有外源 DNA 的動物轉(zhuǎn)基因小鼠；“乳腺反應(yīng)器”工程 哺乳動物的乳腺作為反應(yīng)器；轉(zhuǎn)基因植物 改良植物性狀。 載體的三個基本結(jié)構(gòu)： 1） 至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制；如果要正確表達(dá)還需啟動子和終止子； 2） 至少應(yīng)有一個多克隆位點 ，以供外源 DNA 插入； 3） 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA 分子是否進入宿主細(xì)胞。 為多克隆位點區(qū)：具有多個克隆位點的載體，而且將多個克隆位點集中在一個很短的序列內(nèi)，這種序列常常被稱之為多克隆位點區(qū)。 標(biāo)記基因的 功能 ：①指示哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞， 選擇標(biāo)記基因； ②標(biāo)記基因還有一個十分重要的功能，即指示外源 DNA 分子是否插入載體分子形成了重組子， 篩選標(biāo)記基因。按照克隆載體的 功能或用途來劃分 ：普通型載體或克隆載體、表達(dá)型載體、其它特殊用途類型。使用得最廣泛的動物病毒復(fù)制起點來源子 SV40。 1 普通型載體：這類載體主要用于各種基因組文庫和 cDNA 文庫的建立。它的結(jié)構(gòu)比病毒還要簡單些，只能夠在寄主細(xì)胞內(nèi)獨立地增殖，并隨著宿主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。 2 根據(jù)宿主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)分類：一種是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個宿主細(xì)胞中僅含有 1—3 份的拷貝，我們稱這類質(zhì)粒為“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒；另一類是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個宿主細(xì)胞中可高達(dá) 10 一 60 份拷貝，這類質(zhì)粒被稱為“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。 2 非結(jié)合質(zhì)粒：不含 tra 基因的質(zhì)粒；分子小、拷貝數(shù)多、不會自行結(jié)合轉(zhuǎn)移、比較安全。（ P 表示一種質(zhì)粒） 3 如何判定宿主細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)化？ ：將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在一種加有氨芐青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基上，然后放在 37℃下培養(yǎng)。 3 pBR322 的缺點：保留了轉(zhuǎn)移蛋白（ mob）的 bom 作用位點，能夠被 ColK 質(zhì)粒編碼的mob 蛋白識別，如果再有 F 質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移。 pUC 載體上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位點 (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’ 的合成，但 插入外源基因 就會阻止 LacZ’的合成。 4 Ti質(zhì)粒攜帶著既能合成又能分解這些化合物的酶類的相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，它們只有進入植物細(xì)胞后才能表達(dá)， Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細(xì)胞提供能源、氮源和碳源。 4 T－ DNA 上有三套基因，其中兩套基因 tms、 tmr 分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。由于TDNA 插入植物細(xì)胞染色體中的位置不相同的，因此植物染 色體上可能并沒有可供 TDNA 插入的專一性 DNA 序列。 5 PGV3850 Onc載體特征：它含有 TDNA 邊界區(qū)和 TDNA 區(qū)以外的全部 Ti質(zhì)粒 DNA 序列；位于右側(cè)邊界區(qū)附近編碼胭脂堿合成酶的基因 (Nos)仍然被保留，可作為鑒別轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個標(biāo)記； Onc 致瘤基因已被切除，可以保證被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞得以正常分化； TDNA 內(nèi)部的onc 缺失區(qū)被 pBR322 序列 (含 Apr 基因 )所取代。 5 一元載體：共整合克隆載體系統(tǒng)中間克隆載體；二元載體：雙元克隆載體系統(tǒng)中間克隆載體。由于載體比較小，也稱之為微型 Ti 質(zhì)粒。 5 農(nóng)桿菌內(nèi)為輔助 Ti質(zhì)粒，這類 Ti質(zhì)粒由于缺失了 TDNA 區(qū)域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供 Vir 基因功能，激活 處于反式位置上的 TDNA 的轉(zhuǎn)移。m 質(zhì)粒 6 酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢：酵母菌是最簡單的真核模式生物；全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便；具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國 FDA 認(rèn)定為安全的基因 工程受體系統(tǒng)（ GRAS）；大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉。m 質(zhì)粒約有 60~100 拷貝。m 質(zhì)粒的菌株稱 cir+，丟失了這種質(zhì)粒的菌株稱 cir。m 質(zhì)粒 至少有兩種形式： A 型 (23， R， XY’ )、 B 型 (24， L， XY) 6 2181。m 質(zhì)粒復(fù)制能力的作用。m 質(zhì)粒全部或部分片段構(gòu)成。 6 YRP （復(fù)制型酵母質(zhì)粒）：由細(xì)菌質(zhì)粒和一段含有 ARS 序列的酵母染色體 DNA 構(gòu)建而成，內(nèi)插一段基因標(biāo)記 DNA。但轉(zhuǎn)化體表型不穩(wěn)定，在非選擇性壓力下，每十代 95— 99％表型丟失。g DNA，每個細(xì)胞中拷貝數(shù)只有一個，然而表型穩(wěn)定。這類載體叫 TA 載體。有 61 個基因，各司其職 λ噬菌體基因大致分為 4 個區(qū)（至少 30 個 genes）：結(jié)構(gòu)區(qū)： A～ J19 個基因，編碼頭、 尾部蛋白質(zhì) ；重組區(qū)： att（ attachment）、 int（ intagrate）及 xis（ excission）；調(diào)控區(qū)：啟動子、終止子和 N、 CI 基因； 裂解區(qū) OR 。 根據(jù)外源 DNA 進入載體的方式可以將其分為兩種類型： (1)插入型載體 (2)取代型載體 插入型載體：即把外源 DNA 或 cDNA 插入載體中的某個遺傳標(biāo)記基因中而使其失活。 .組成： DNA： cos 序列和控制包裝的的序列（ kb）； pBR322：質(zhì)粒復(fù)制起點（ colE1），抗性標(biāo)記 ampr。 1 M13 噬菌體的復(fù)制和增殖： M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌，感染后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長和分裂。 1 M13mp 系列載體：以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區(qū)域 作為外源 DNA 插入?yún)^(qū)。 M13mp7— 對稱的多克隆位點：將多聚接頭（ MCS）插入到 M13mp2 的 EcoR I 位點上，就產(chǎn)生了 M13mp7。阻遏蛋白表達(dá)高 10 倍（ 4） proAB 細(xì)菌染色體上脯氨酸生物合成酶類的編碼區(qū)域。（ 7） recA1 大腸桿菌重組酶基因。 2 重要的噬菌粒載體： pUC118 / 119： pUC118 pUC18 + M13 間隔區(qū) IG； pUC119 pUC19 + M13 間隔區(qū) IG 2 pEMBL8 噬菌粒：在 pUC8 中插入了一個 1300bp 的 M13 基因組。 2 P1 噬菌體基本結(jié)構(gòu)與特征：（ 1） 基因組長 88 kb, 在噬菌體顆粒中的 DNA 長 100 kb, 呈線狀 ,兩端約有 12%的多余 DNA。第二次切割是隨機的，無特異性 DNA 序列。② pac 位點 : 一端含 4 個六聚體 (5’ TGATCA/G 3’ )，另一端則有三個，中間區(qū)域長 90 bp， pacase 切點位于靠近 90 bp 區(qū)的中心序列。 克隆過程更可靠 。 限制性核酸內(nèi)切酶：來源：原核生物； 性質(zhì)：內(nèi)切酶（即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶）；功能：自我保護作用（降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。① Dam 甲基化酶： GATC 腺嘌呤 N6 位置引入甲基；② Dcm 甲基化酶： CCAGG或 CCTGG 序列在第二個 C 上 C5 位置上引入甲基。（ 2）切割位點：在距離特異性識別位點約 1000— 1500 bp 處隨機切開一條單鏈。 III 類限制性內(nèi)切酶：在識別位點下游 2426bp 切割 DNA，但反應(yīng)需要 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。① 大多數(shù)為回文對稱 /旋轉(zhuǎn)對稱，② 非對稱，③ 多識 別序列 (簡并序列 )，④ 間斷對稱。（ 4）粘性末端的意義。（ 8）歸位內(nèi)切酶。 1 同裂酶和同位酶：識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 1 Ⅱ s 型限制性內(nèi)切酶：漂移切割：在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割 DNA雙鏈。 1 切口酶：有些限制酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，稱之切口酶。 1 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：① DNA 的純度：（純化 DNA，加大酶的用量，延長保溫時間，擴大反應(yīng)體積（ 20μι）；② 緩沖液：是影響限制酶活性的重要因素（ MgClNaCl/KCl：提供 Mg2+和離子 強度； TrisHCl：維持 pH； 二硫蘇糖醇（ DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白 BSA 等：有助于酶的穩(wěn)定）③溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，大多數(shù)是 37 oC，少數(shù)要求 4065 oC。引起星星活性的因素 ：① 高濃度甘油（ 5%） ② 酶過量（ 100U/μ g）酶與底物DNA 比例過高③ 低離子強度（ 25mM） ④ 高 pH () ⑤ 有機溶劑 ⑥ 用其它二價陽離子代替 Mg++。 2 內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式：①完全酶切：內(nèi)切酶在 DNA 上的所有識別位點都被切開；②部分酶切：只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。 2 限制酶酶切反應(yīng)的終止：大多數(shù)酶可用 65 oC 溫育 5 分鐘失活。①限制性內(nèi)切酶酶切后；②電泳分離 DNA 片段；③轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針雜交，⑤分析陽性條帶 兩種 DNA 連接酶：（ 1）大腸桿菌連接酶：只能連接粘性末端。 （ 3）需要能量：動物或噬菌體中： ATP ，大腸桿菌中： NAD+ 3 DNA 連接酶連接反應(yīng)的溫度：最佳溫度：連接酶反應(yīng)的最佳溫度是 37 度。 3 連接酶的應(yīng)用：寡核苷酸連接測定（ OLA），連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ LCR） 3 DNA 片段的連接策略：黏性末端、平末端、黏性末端＋平末端 3 互補粘性末端的連接：①同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割；②兩種同尾酶切割。 2. 末端連接上連接桿法和銜接頭法 4 DNA 片段末端同聚物加尾后進行連接：用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ TDT）。 4 cDNA 鏈的合成：通過 DNA 聚合酶合成 第二鏈；加入 Sal I 銜接物； S I 核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由 Klenow 補齊，加入第二銜接物 Ecol I 4 黏性末端＋平末端連接：互補多聚尾巴；銜接物；平末端連接 4 DNA 重組類型：插入重組，置換重組 4 重組率定義：重組率 =含有外源 DNA 的重組分子數(shù) /載體分子總數(shù)；在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為 25 75%。對載體的 5’末端進行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。