【正文】 尿素凝膠 羥甲基汞凝膠 。 原理： Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），其原理是 Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙。 1掌握以堿裂解法提取質(zhì)粒主要用什么試劑？各有什么作用？幾大步驟中各會發(fā)生怎樣的現(xiàn)象？ 答： 溶液 I（溶液呈黃色懸濁液）：葡萄糖（維持滲透壓，保持結(jié)構(gòu)完整性、用于懸?。?、 Tris（維持一定粒子強度及 PH值）、 EDTA（螯合金屬離子，抑制 DNA 酶的作用）。由α 互補而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG 的作用下，在生色底物 XGal存在時產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA 的短區(qū)段，其中有β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和前 146個氨基酸的編碼信息。 類型：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有 1～ 2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有 20個左右質(zhì)粒。當(dāng)有接合性質(zhì)粒中 F因子能夠?qū)е滦皂毜暮铣?，提供轉(zhuǎn)移裝臵，則可以轉(zhuǎn)移。 分為： ① F質(zhì)粒（致育質(zhì)粒，可以通過接合，在供體和受體間傳遞遺傳物質(zhì)） ② R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒，帶有抗性基因，可使宿主菌對某些抗菌素產(chǎn)生抗性） ③ Col 質(zhì)粒：帶有編碼大腸桿菌素的基因。 （ 5）季節(jié)因素（溫度）： RNase降解 RNA溫度高活性高，需要低溫進(jìn)行。 “安全”的宿主 — 載體體系？ 答：失去自我遷移能力，可以是營養(yǎng)缺陷性，在自然環(huán)境下無法生存。 ？ 答：（ 1）跨越天然的物種屏障（ 2）確定的 DNA 擴增 ？ 答：酶切分離目的基因→重組 DNA 分子→轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞增殖→獲得篩選目的重組子 (→提取目的基因供進(jìn)一步研究→重組目的基因功能表達(dá) ) ? 答： (1)帶來體外蛋白質(zhì)化學(xué)的革命 :甲型干擾素， 紅細(xì)胞生成素。 （ 2） 對檢測技術(shù)的貢獻(xiàn)：提供大量高純靶，提高準(zhǔn)確性；病原體檢出（ HCV HBV HIV）；遺傳病診斷。 第一章 基因操作基本技術(shù) 提取細(xì)胞總 RNA 的原則是什么？如何實施？為什么 ? 答 : 原則：抑制 RNA酶活性 實施：（ 1）高溫： 180℃， 2小時，滅活 RNase （ 2）二乙基焦炭酸乙酯（ DEPC） ,油狀有毒 , 是一種強烈但不徹底的RNA 酶抑制劑。 RNA 制品質(zhì)量控制？ 答： 1） RNA的濃度和純度測定 A260nm 1 OD=40 ?g/ml RNA 要求 A260nm/A280nm= ( ) A260nm/A230nm 2） RNA的完整性 變性瓊脂糖凝膠電泳檢查 28S： 18S?2： 1 3）總 RNA制品的保存 溶液法（ TE或 %SDS 方便 但不穩(wěn)定 ) 懸液法（溶液加 3V乙醇 可靠 但不方便） DNA 制備的原則是什么？各有哪些主要試劑？作用？ 答：原則：祛除蛋白及細(xì)胞碎片，祛除 RNA，保持 DNA 分子完整。 ④降解質(zhì)粒：可使宿主代謝特殊分子 ⑤侵入性質(zhì)粒：使宿主菌具有致病能力 ？什么是質(zhì)粒的遷移？遷移原理？ 答：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移：從一個 細(xì)胞自我的轉(zhuǎn)移到原來不存在這種質(zhì)粒的另一個細(xì)胞去。如果沒有，缺口可能還原維持兩種構(gòu)象的動態(tài)平衡。 ？ 答：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（ MCS），它并不破壞讀框，但可使少 數(shù)幾個氨基酸插入到β 半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β 半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主細(xì)胞。然而，當(dāng)外源DNA 插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α 互補能力的氨基端片段，使 得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 溶液 II（溶液變粘稠，流動性下降）： NaOH（高濃度，釋放出的物質(zhì)在強堿條 件下變性形成沉淀）、 SDS（去膜劑，使膜溶解，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)） 溶液 III（很多白色沉淀，流動性較好）： KAC （中和溶液 II 的堿性，染色體 DNA 不能復(fù)性，而質(zhì)粒是小分子可以復(fù)性重新溶解，以此來分離染色體 DNA 與質(zhì)粒，剩下的沉淀是細(xì)胞碎片和不能溶解的DNA） 進(jìn)一步： CsCl（密度梯度離心）、 NaCl（密度梯度離心）、 Sepharose（凝膠過濾）。 ？如何制備 RNA 變性凝膠？ 答：（ 1）蛋白質(zhì)核酸等大分子在電場的作用下，在緩沖液中涌動的現(xiàn)象。 答：分辨力高、容量大（ 10ug）、回收片段純度高。原理：制備染色體長片段加在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小及作用時間交替變化，兩電場方向垂直， DNA分子的遷移方向隨所用的電場方向周期性變化而不斷改變。 原因：信息量豐富，不同生物含可區(qū)別的 DNA 序列，穩(wěn)定性（不像蛋白等不易保存） 特性：一般為單鏈探針：雜交速度快 /效率高，濃度高，可 進(jìn)行標(biāo)記，可檢測點突變。在 DNA 聚合酶 I的作用下 5’→ 3’ 外切，并在 5’ → 3’ 合上新底物（探針），標(biāo)記一條鏈。 （ 4）體外轉(zhuǎn)錄：非細(xì)胞狀態(tài)下完成轉(zhuǎn)錄，借助一定的載體及外源 DNA插入載體的克隆位點，采用合適的限制性內(nèi)切酶將載體線性化，上游啟動子起始轉(zhuǎn)錄，在 RNA聚合酶的作用下以帶標(biāo)記的 dNTP為底物合成新鏈。什么是同尾酶？ 答：識別特性 :識別由 48個核苷酸組成的呈回文結(jié)構(gòu)的特定序列。 2掌握 II 型限制性內(nèi)切酶的識別特性與切割片段大小之間的關(guān)系。 答：（連接單位定義： 16176。 3堿性磷酸酶、 S1 酶、 Bal31 酶、 Klenow 酶的功能及其用途是什么？ 答： 堿性磷酸酶：去磷酸化 —— 防止載體自連 S1 酶：切割單鏈 —— 末端修飾、切開回折、 RNA作圖 Bal31 酶： 5→ 3/3→ 5外切 —— 誘發(fā)基因的缺失突變、酶譜 Klenow 酶：末端放射性標(biāo)記 —— DNA 聚合酶 I大片段，只是從 DNA聚合酶 I全酶中去除 5’ → 3’ 外切酶活性。 PCR由變性 —— 退火 —— 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。 重復(fù)循環(huán)變性 _退火 _延伸三過程，就可獲得更多的?半保留復(fù)制鏈?。 解聚方法：發(fā)展新酶或合成能力強的酶； 三羥甲基甘氨酸可增加 PH穩(wěn)定性。 凝膠電泳分析： PCR產(chǎn)物電泳， EB 染色紫外成像儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。 酶切分析：根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點， 用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 斑點雜交：將 PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于 PCR 產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分別用多聚 dC 和已知的序列作為引物進(jìn)行 PCR擴增。 得到單鏈，更適宜測序，單鏈還可作為探針。 1什么是原位 PCR? 應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行 PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術(shù)的優(yōu)點。 第三章核酸分析與合成 末端終止法進(jìn)行 DNA 測序的原理。在 DNA合成反應(yīng)混合物的 4種普通 dNTP中加入少量的一種 ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位臵間的距離。 答：（ 1）插入型載體 :只有一個位點外源基因在此插入。（容量： 31~45kb ） 特點： 具有 ? 噬