【正文】 5個基因 III編碼的蛋白質(zhì)（功能：噬菌體顆粒的正確組裝，作用于大腸桿菌雄性細胞 F性須的吸附過程）。當(dāng)外源 DNA 片段被插入在噬菌體展示載體的基因 III 編碼序列中，在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會產(chǎn)生由克隆基因與基因 III聯(lián)合編碼的融合蛋白。用于構(gòu)建噬菌體表面展示文庫等。 第五章目的基因的準備和重組及重組子的鑒定 什么是 cDNA 文庫和基因組 DNA 文庫？各有怎樣的優(yōu)缺點？ 答： cDNA文庫：以 mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個 細菌含有一段 cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的 cDNA克隆集合稱為該組織細胞的 cDNA文庫。 cDNA文庫具有組織細胞特異性，比基因組 DNA 文庫小的多，從中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除內(nèi)含子的 cDNA。 基因組 DNA 文庫：指將某生物的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度的 DNA 片段，再與適合的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。 cDNA基因文庫的優(yōu)點：病毒 RNA的研究（只能構(gòu)建 cDNA文庫）、篩選簡單、 cDNA文庫直接是表達序列、可用于測定基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子 外顯子）、時間調(diào)節(jié)基因表達特征分析。 缺點：無調(diào)節(jié)序列、低豐度 mRNA克隆難（從文庫中難以獲得） 如何計算構(gòu)建文庫時的規(guī)模？其影響因素有哪些？ 答： Clerkeamp。Carbon 公式： N=ln(1p)/ln(1f/g) N：文庫的規(guī)模，即想要獲得某一 DNA 片段所需文庫大小。 p：概率，獲得某一片段的可能性。 f/g：特異 mRNA拷貝數(shù) /總 mRNA種類 可克隆片段大小 /基因組總長度 影響因素： mRNA豐度、克隆基因的大小 (載體容量 ) cDNA 文庫構(gòu)建 過程及其關(guān)鍵步驟的處理和分析。 答：（ 1） RNA的制備及純化 ①總 RNA的提取 ② mRNA的純化 oligodT纖維素柱層析 ③特異 mRNA的富集（ mRNA分級分離、 蔗糖密度梯度離心） ④特異 mRNA的分析鑒定 * mRNA 體外翻譯（麥胚、兔網(wǎng)織紅細胞） * RNA 電泳 Northern Blot （ 2） cDNA兩鏈的合成 (RNA酶 H 法、自身引物法、試劑盒 ) （ 3） 雙鏈 cDNA分子與載體的連接：同聚物加尾、 inker連接子 （ 4）重組體導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電脈沖 、 cDNA 雙鏈合成過程。 答 ：（ 1）利用 RNA酶 H，以 oligo （ dT ）作為引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成RNADNA雜合體。 （ 2）自身引物法：以 oligo （ dT ）作為引物，合成 3’ OH，自身作為引物合成另一條鏈、用 S1切開使平端化。 （ 3）運用試劑盒 什么是同聚物加尾？ 答：在載體和要插入的 DNA 片段分別加上 poly A和 poly T，形成粘性末端；使片段練到載體上。 cDNA 文庫的檢測方法及其原理？ 答： ○ 1 、遺傳檢測：利 用載體提供的表型特征 、 插入基因功能表達 ○物理檢測：凝膠電泳（重組體插入片段分子量增大，但此方法操作麻煩） ○4 、免疫化學(xué)檢測： *標記抗體探針 *免疫沉淀（免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。） ○5 、轉(zhuǎn)譯篩選法 *雜交抑制的轉(zhuǎn)譯 豐富 mRNA *雜交選擇的轉(zhuǎn)譯 低豐度 mRNAinsulin ○ 6 、正負篩選法：組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達差異 基因組 DNA 文庫如何制備？ 基因組 DNA 文庫構(gòu)建時， 為防止外源 DNA 片段之間的連接，可采用哪些措施？ 答：（ 1）將待連接的 DNA 片段根據(jù)載體的裝載量分級分離 （ 2）用堿性磷酸單酯酶除去 DNA 片段的末端磷酸基團 （ 3）用 TdT酶在 DNA 片段的末端上增補同聚尾末端 第六章基因在原核及真核體系中的表達 真核基因在大腸桿菌中的表達存在的問題及其解決辦法。 答：理論上的困難 : 遺傳機制的差異 基因結(jié)構(gòu)（ cDNA代替基因組 DNA） 轉(zhuǎn)錄信號（ SD） （使用原核啟動子及 SD 序列） 細菌蛋白酶（引入突變體 抑制基因） mRNA 結(jié)構(gòu)、蛋白的后加工（無法解決） 真核 克隆基因在大腸桿菌中表達的基本條件。 答：（ 1）啟動子（含啟動子才能表達）、 （ 2）含有 SD 序列 、 （ 3）正確插入方向（起始密碼子靠近啟動子） 提高克隆基因在大腸桿菌中表達效率的途徑。 答： ○ 1 、啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響 （ 35 與 10間 17bp 最高活性） ○ 轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響 —— 轉(zhuǎn)錄不翻譯區(qū) 轉(zhuǎn)譯起始的保守序列： AUG、 SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖體的結(jié)合位點有一個或幾個終止密碼子、含全部或部分 PuPuUUUPuPu 其他： SD后的 4堿基 4 A或 4T（ GC 則 25%50%）、起始密碼子左邊 UAU、CUU 最好， UUC UCA AGG 下降 20倍 ○3 、 啟動子同克隆基因間距離對表達效率的影響（不確定，與通過探測得知。 ○4 、質(zhì)?？截悢?shù)對表達效率的影響 （條件致死型載體） —— 一般越多越好 ○5 、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對克隆基因表達效率的影響 終止區(qū)存在的必要性： （ 1）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外 源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； （ 2）如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； （ 3）過長的 mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗 （ 4） 過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 ○6 、質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性對效率的影響 *質(zhì)粒分配由 par控制 *克隆該基因 *保持選擇壓力 *反選擇：質(zhì) 粒含 CI， 宿主是溶源化細菌，其噬菌體啟動子缺陷 ○7 、密碼子的使用頻率 (bias)—— 密碼子的偏愛性 外源 DNA 導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法及其原理和特點。 答： (i)磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)； (ii)DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)； (iii)聚陽離子 DSMO 轉(zhuǎn)染技術(shù)； (iv)電穿孔技術(shù)； (v)顯微注射技術(shù)； (Vi)原生質(zhì)體融合技術(shù)。 什么是電穿孔法？什么是脂質(zhì)載體法？有怎樣的特點 ? 答： （ 1）電穿孔 (electroporation)是指在高壓電脈沖的作用下使細胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞。從 而導(dǎo)致不同細胞之間的原生質(zhì)膜發(fā)生融合作用的細胞生物學(xué)過程。 (幾乎所有類型的細胞，都可以成功地使用電穿孔技術(shù)進行基因轉(zhuǎn)移。此項技術(shù)具有操作簡便，基因轉(zhuǎn)移效率高等優(yōu)點。 ) （ 2）脂質(zhì)體 (liposomes)是一種人造的脂質(zhì)小泡 (lipid vesicles)，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔。用它作載體可以把外源 DNA 導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。 (制備簡單，易消毒 。包裝的 DNA 4? C 長期不失活 。毒性低，包裝容量大 。保護 DNA 免受核酸酶降解 。效率低 ) 研究 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法及其原理。 答： ○ 1 凝膠阻滯試驗 (gel retardation assay) 原理： DNA結(jié)合蛋白運動變緩 應(yīng)用：研究轉(zhuǎn)錄因子及 DNA 的作用；突