【正文】 主要內容 : 第一章 基因操作的基本技術 核酸制備；質粒及質粒載體；細菌的轉化；凝膠電泳；核酸探針；限制性內切酶、酶切圖譜及分子克隆用酶 第二章 PCR 技術 第三章 核酸分析與合成 第四章 噬菌體載體及粘粒 第五章 目的基因的準備和重組及重組子的鑒定 第六章 基因在原核及真核體系中的表達 真核基因在大腸桿菌中的表達；哺乳動物基因工程；研究 DNA與蛋白質相互作用的方法 第七章 植物基因工程 第八章 基因工程研究進展 人類基因組計劃；基因診斷、基因治療和轉基因；反義技術 序言： ？基因工程是如何誕生的 ？ 答：在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子中，構成遺傳物質的新組合，并使之摻入到原先沒有這類分子的宿主細胞中，并能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。 ？ 答：（ 1）跨越天然的物種屏障（ 2）確定的 DNA 擴增 ？ 答：酶切分離目的基因→重組 DNA 分子→轉移至受體細胞增殖→獲得篩選目的重組子 (→提取目的基因供進一步研究→重組目的基因功能表達 ) ? 答： (1)帶來體外蛋白質化學的革命 :甲型干擾素， 紅細胞生成素。 （ 2） 對檢測技術的貢獻：提供大量高純靶，提高準確性；病原體檢出（ HCV HBV HIV）；遺傳病診斷。 （ 3）直接的遺傳性疾病治療和生物體改造：轉基因動植物。 （ 4）促進對生命現(xiàn)象本質機理的研究：胰島素基因與糖尿病、癌基因與抗癌基因。 “安全”的宿主 — 載體體系？ 答：失去自我遷移能力，可以是營養(yǎng)缺陷性，在自然環(huán)境下無法生存。 第一章 基因操作基本技術 提取細胞總 RNA 的原則是什么？如何實施？為什么 ? 答 : 原則：抑制 RNA酶活性 實施：（ 1）高溫： 180℃， 2小時，滅活 RNase （ 2）二乙基焦炭酸乙酯（ DEPC） ,油狀有毒 , 是一種強烈但不徹底的RNA 酶抑制劑。它使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。 （ 3）使用對 RNase有強烈乙酯作用的細胞裂解劑，如鹽酸胍、異硫氰胍（裂解細胞、抑制酶活性、解聚核糖體） （ 4）帶手套、口罩：阻斷 RNA酶來源，加少污染機會。 （ 5）季節(jié)因素（溫度）： RNase降解 RNA溫度高活性高，需要低溫進行。 RNA 制品質量控制？ 答： 1） RNA的濃度和純度測定 A260nm 1 OD=40 ?g/ml RNA 要求 A260nm/A280nm= ( ) A260nm/A230nm 2） RNA的完整性 變性瓊脂糖凝膠電泳檢查 28S： 18S?2： 1 3）總 RNA制品的保存 溶液法（ TE或 %SDS 方便 但不穩(wěn)定 ) 懸液法（溶液加 3V乙醇 可靠 但不方便） DNA 制備的原則是什么？各有哪些主要試劑？作用？ 答：原則：祛除蛋白及細胞碎片，祛除 RNA，保持 DNA 分子完整。 主要試劑及作用： SDS（破壞細胞膜結構、變性蛋白質、解聚） EDTA（抑制酶活性） Proteinase K（蛋白酶消化蛋白質） DNA 樣品的鑒定？ 答： A260nm 1 OD=50 ?g/ml DNA 要求 A260nm/A280nm A260nm/A230nm 5. 有哪些方法可以進行 DNA 片段的制備？是如何進行的？ 答：（ 1）低熔點瓊脂糖（羥乙基 60?C65 ?C熔化，結果較純） （ 2）透析袋法：需要把樣品濃縮，把核酸沉淀，而去掉緩沖液。 （ 3）苯酚抽提法 （ 4）反復凍融法：多次凍融使凝膠收到破壞，釋放其中 DNA，但回收率低 （ 5）電洗脫法 （ 6）硝酸纖維素膜離心法（ 7）試劑盒 ？質粒有幾類？ 答：質粒是一類亞細胞有機體，存在于細胞質中獨立于染色體的遺傳成分，由環(huán)狀雙鏈 DNA 組成的復制子。 分為： ① F質粒（致育質粒，可以通過接合，在供體和受體間傳遞遺傳物質） ② R質粒（抗性質粒，帶有抗性基因，可使宿主菌對某些抗菌素產(chǎn)生抗性） ③ Col 質粒：帶有編碼大腸桿菌素的基因。 ④降解質粒：可使宿主代謝特殊分子 ⑤侵入性質粒：使宿主菌具有致病能力 ？什么是質粒的遷移？遷移原理？ 答：質粒的轉移：從一個 細胞自我的轉移到原來不存在這種質粒的另一個細胞去。 質粒的遷移：由共存的接合型質粒引發(fā)非接合型質粒的轉移過程。 原理：當相容性的接合質粒和非接合質粒在同一細胞中，非接合質粒中mob 編碼的核酸酶作用其特異位點 bom，使 bom 位點發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，構象轉變?yōu)槿笨诃h(huán)狀構象。當有接合性質粒中 F因子能夠導致性須的合成，提供轉移裝臵，則可以轉移。如果沒有，缺口可能還原維持兩種構象的動態(tài)平衡。 ？質粒的復制類型？ 答：定義：生長在標準培養(yǎng)條件下，每個細菌細胞中所含有的質粒 DNA分子的數(shù)目。非 標準培養(yǎng)條件下，每個細菌細胞染色體平均具有的質粒DNA 分子的數(shù)目。 類型：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有 1～ 2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內一般有 20個左右質粒。 ？ 答：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒不能在同一個宿主細胞中穩(wěn)定存在。 ？為什么？ 答： (i) 具若干限制酶單一識別位點：可提供多種選擇，具有多個同一種酶切位點則可能被切碎 (ii) 具有復制起點：可導入宿主細胞，也是質粒自我增值必不可少條件（ iii）具有選擇標記：便于篩選（ iv）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)：操作簡單，可攜帶較大片段的基因，并有利于載體的穩(wěn)定。 LacZ 的篩選原理是什么？ 答：是重組子篩選的一種方法： 是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α 互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA 的短區(qū)段，其中有β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調控序列和前 146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（ MCS），它并不破壞讀框，但可使少 數(shù)幾個氨基酸插入到β 半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β 半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣， lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α 互補。由α 互補而產(chǎn)生的 LacZ+細菌在誘導劑 IPTG 的作用下，在生色底物 XGal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA 插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α 互補能力的氨基端片段，使 得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉化的鈣化菌平板 37℃溫箱倒臵培養(yǎng) 1216hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。 1掌握以堿裂解法提取質粒主要用什么試劑？各有什么作用？幾大步驟中各會發(fā)生怎樣的現(xiàn)象？ 答： 溶液 I（溶液呈黃色懸濁液）：葡萄糖（維持滲透壓，保持結構完整性、用于懸?。?、 Tris（維持一定粒子強度及 PH值）、 EDTA（螯合金屬離子，抑制 DNA 酶的作用）。 溶液 II（溶液變粘稠，流動性下降）： NaOH（高濃度，釋放出的物質在強堿條 件下變性形成沉淀）、 SDS（去膜劑，使膜溶解，釋放細胞內物質） 溶液 III（很多白色沉淀，流動性較好）： KAC （中和溶液 II 的堿性，染色體 DNA 不能復性，而質粒是小分子可以復性重新溶解，以此來分離