【正文】 v. 競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng) vi. 可傳播性系統(tǒng)性的 RNAi包括了 SID1介導(dǎo)的雙鏈 RNA在細(xì)胞間的運(yùn)輸 。 i. 高效性： 1～ 100 nmol/L的雙鏈 RNA濃度對(duì)基因沉默的效果是一致的 ii. 特異性： 21～ 23 個(gè)堿基對(duì)中有 1～ 2個(gè)堿基錯(cuò)配會(huì)大大降低對(duì)靶mRNA 的降解效果。 1什么是 RNAi？ RNAi 的工作原理及其特點(diǎn)。線(xiàn)性不穩(wěn)定、有共克隆現(xiàn)象使結(jié)果不可信。 芯片：一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。 BAC（細(xì)菌人工染色體）：由大腸桿菌單拷貝 F質(zhì)粒衍生而成的，可用于克隆基因組大片段 DNA 及構(gòu)建基因組文庫(kù)的克隆載體。 MS（微衛(wèi)星）：基因組中由短的重復(fù)單元 (一般為 1～ 6個(gè)堿基 )組成的DNA 串聯(lián)重復(fù)序列。 STS（序列標(biāo)簽位點(diǎn)）：作為基因組物理圖中位臵標(biāo)志的已知小段單拷貝獨(dú)特的 DNA 序列。 答： A 以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)化 （ 1） 土壤農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒介導(dǎo) 的遺傳轉(zhuǎn)化 長(zhǎng)度： 200~250kb 章魚(yú)堿 胭脂堿 ? 轉(zhuǎn)化載體： 共整合載體 pBR322含 Ti基因及外源基因，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，同源重組使外源基因整合于 Ti 質(zhì)粒 雙元載體系統(tǒng) 一個(gè) Ti 提供 Vir功能，另一個(gè)有目的基因、選擇標(biāo)記、移動(dòng)復(fù)制功能 ? 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)： 葉盤(pán)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：新切的葉圓片 +農(nóng)桿菌 ? 篩選培養(yǎng)基 ? 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 ? 再生植株 （ 2） 植物 DNA 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 花椰菜花葉病毒、雀麥條斑病毒、雙子座病毒 缺點(diǎn)：外源 DNA 易被排斥、易喪失感染力、寄主范圍狹窄 B、 DNA的直接轉(zhuǎn)移法 (1)電擊法 : (2)基因槍法 ：鎢或金 ~? m (3)激光微束穿孔法 (4)顯微注射 (5)脂質(zhì)體介導(dǎo)法 (liposome) (6)多聚物介導(dǎo)法 PEG (7)花粉管通道法 第八章 基因工程研究進(jìn)展 人類(lèi)基因組計(jì)劃包括哪幾方面的內(nèi)容？ 答： ○ 1 作圖 (Mapping)：將染色體或 DNA 上的標(biāo)記定位（ 14 萬(wàn)個(gè)基因） 什么是遺傳連鎖圖？什么是物理圖？ 答： 遺傳連鎖圖 (geic linkage map) ：采用遺傳學(xué)分析方法（兩點(diǎn)、三點(diǎn)作圖）將基因或其他 DNA 序 列標(biāo)定在染色體上；單位 cM（厘摩 1%交換率） 物理圖 (physical map) ：有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過(guò)對(duì)構(gòu)成基因組的 DNA 分子進(jìn)行測(cè)定而繪制的。過(guò)比較兩種不同細(xì)胞類(lèi)型或在不同生長(zhǎng)條件下同種細(xì)胞類(lèi)型來(lái)源的擴(kuò)增 cDNA產(chǎn)物的電泳帶譜，能夠用于鑒定其表達(dá)基因圖譜的差異。 什么是基因挽救技術(shù)？什么是 cDNA 差異顯示技術(shù)？ 答：（ 1）有選擇壓力性狀植株 ? 基因組 ? 連入穿梭載體 ? 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 ? 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 ? 在選擇壓力 下選擇抗性植株 ? 以 TDNA 為探針選擇目標(biāo)基因 （ 2） cDNA差異顯示技術(shù)：該實(shí)驗(yàn)方法是針對(duì)從特定細(xì)胞或組織類(lèi)型的 mRNA池來(lái)源的樣品用 PCR技術(shù)對(duì)其中許多的 cDNA基因一起進(jìn)行擴(kuò)增和顯示的實(shí)驗(yàn)方法。然后用已克隆的轉(zhuǎn)座子為探針，對(duì)突變株系進(jìn)行 Southem 分析，通過(guò)常規(guī)分子克隆 (如構(gòu)建基因文庫(kù) )分離目的基因片段。 （ 2） 轉(zhuǎn)座子示 蹤技術(shù)：根據(jù)植物或細(xì)胞的表型變異進(jìn)行基因分離的有效手段。 答： （ 1） Ti 是在根瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈 DNA 分子。酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子 (如 GAL4等 )的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和 GAL4激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。 應(yīng)用：受體 抗體作用，免疫反應(yīng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu) 缺陷： bait 有內(nèi)在 DNA 結(jié)合及激活活性時(shí) 蛋白不能穩(wěn)定表達(dá)或定位于核 蛋白不能正確折疊或后加工 (2)單雜交系統(tǒng) (onehybrid system) 分離與一個(gè)順式作用元件結(jié)合的蛋白基因 (3)三雜交系統(tǒng) (threehybrid system) 由蛋白、激酶、小分子、 RNA介導(dǎo)的 BDX與 ADY的作用 什么是酵母雜交系統(tǒng)其工作原理及特點(diǎn)。 答： ○ 1 凝膠阻滯試驗(yàn) (gel retardation assay) 原理： DNA結(jié)合蛋白運(yùn)動(dòng)變緩 應(yīng)用：研究轉(zhuǎn)錄因子及 DNA 的作用；突變對(duì)該作用的影響 ○ 2 DNaseI 足跡試驗(yàn) (footprinting assay) 原理： DNaseI隨機(jī)切割，相差一個(gè)核苷酸，產(chǎn)生 10 類(lèi)片段（在不同分子上） 應(yīng)用：研究轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 作用的確切位點(diǎn)及突變對(duì)該作用的影響 ○ 3 甲基化干擾試驗(yàn) 原理：甲基化作用干擾蛋白與 DNA的作用，硫酸二甲酯 (DMS)可使 G甲基化，利于六氫吡啶切割 應(yīng)用：研究作用的確切位點(diǎn)；同理可研究 A， 但不能研究 T、 C ○ 4 體內(nèi)足跡試驗(yàn)（ DMS 自然滲透） ○ 5 酵母雜交系統(tǒng) (yeast hybrid systems)：體內(nèi)識(shí)別編碼與目標(biāo)蛋白作用的蛋白基因方法 —— 天然狀態(tài)，弱，短 (1) 雙雜交系統(tǒng) 在細(xì)胞內(nèi)檢查兩種蛋白質(zhì)是否相互作用結(jié)合的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。保護(hù) DNA 免受核酸酶降解 。包裝的 DNA 4? C 長(zhǎng)期不失活 。用它作載體可以把外源 DNA 導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此項(xiàng)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，基因轉(zhuǎn)移效率高等優(yōu)點(diǎn)。從 而導(dǎo)致不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)膜發(fā)生融合作用的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。 答： (i)磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)； (ii)DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)； (iii)聚陽(yáng)離子 DSMO 轉(zhuǎn)染技術(shù)； (iv)電穿孔技術(shù)； (v)顯微注射技術(shù)； (Vi)原生質(zhì)體融合技術(shù)。 答： ○ 1 、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 （ 35 與 10間 17bp 最高活性） ○ 轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 —— 轉(zhuǎn)錄不翻譯區(qū) 轉(zhuǎn)譯起始的保守序列： AUG、 SD(UAAGGAGGU的部分或全部）、核糖體的結(jié)合位點(diǎn)有一個(gè)或幾個(gè)終止密碼子、含全部或部分 PuPuUUUPuPu 其他： SD后的 4堿基 4 A或 4T（ GC 則 25%50%）、起始密碼子左邊 UAU、CUU 最好， UUC UCA AGG 下降 20倍 ○3 、 啟動(dòng)子同克隆基因間距離對(duì)表達(dá)效率的影響（不確定，與通過(guò)探測(cè)得知。 答：理論上的困難 : 遺傳機(jī)制的差異 基因結(jié)構(gòu)（ cDNA代替基因組 DNA） 轉(zhuǎn)錄信號(hào)（ SD） （使用原核啟動(dòng)子及 SD 序列） 細(xì)菌蛋白酶（引入突變體 抑制基因） mRNA 結(jié)構(gòu)、蛋白的后加工（無(wú)法解決） 真核 克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)的基本條件。 cDNA 文庫(kù)的檢測(cè)方法及其原理？ 答： ○ 1 、遺傳檢測(cè)：利 用載體提供的表型特征 、 插入基因功能表達(dá) ○物理檢測(cè)：凝膠電泳（重組體插入片段分子量增大，但此方法操作麻煩） ○4 、免疫化學(xué)檢測(cè)： *標(biāo)記抗體探針 *免疫沉淀（免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。 （ 2）自身引物法：以 oligo （ dT ）作為引物，合成 3’ OH，自身作為引物合成另一條鏈、用 S1切開(kāi)使平端化。 答：（ 1） RNA的制備及純化 ①總 RNA的提取 ② mRNA的純化 oligodT纖維素柱層析 ③特異 mRNA的富集（ mRNA分級(jí)分離、 蔗糖密度梯度離心） ④特異 mRNA的分析鑒定