【導(dǎo)讀】基因工程是如何誕生的？直接的遺傳性疾病治療和生物體改造：轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物?！鞍踩钡乃拗鳌d體體系？它使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。RNA制品質(zhì)量控制？分，由環(huán)狀雙鏈DNA組成的復(fù)制子。出現(xiàn)缺口，構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槿笨诃h(huán)狀構(gòu)象。導(dǎo)致性須的合成，提供轉(zhuǎn)移裝臵，則可以轉(zhuǎn)移。原維持兩種構(gòu)象的動(dòng)態(tài)平衡。非標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞染色體平均具有的質(zhì)粒。如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。離子，抑制DNA酶的作用）。

　　

【正文】 變對(duì)該作用的影響 ○ 2 DNaseI 足跡試驗(yàn) (footprinting assay) 原理： DNaseI隨機(jī)切割，相差一個(gè)核苷酸，產(chǎn)生 10 類片段（在不同分子上） 應(yīng)用：研究轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 作用的確切位點(diǎn)及突變對(duì)該作用的影響 ○ 3 甲基化干擾試驗(yàn) 原理：甲基化作用干擾蛋白與 DNA的作用，硫酸二甲酯 (DMS)可使 G甲基化，利于六氫吡啶切割 應(yīng)用：研究作用的確切位點(diǎn)；同理可研究 A， 但不能研究 T、 C ○ 4 體內(nèi)足跡試驗(yàn)（ DMS 自然滲透） ○ 5 酵母雜交系統(tǒng) (yeast hybrid systems)：體內(nèi)識(shí)別編碼與目標(biāo)蛋白作用的蛋白基因方法 —— 天然狀態(tài)，弱，短 (1) 雙雜交系統(tǒng) 在細(xì)胞內(nèi)檢查兩種蛋白質(zhì)是否相互作用結(jié)合的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。構(gòu)建這兩種蛋白質(zhì)分別與反式激活轉(zhuǎn)錄因子的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (BD)及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (AD)相連的融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入同一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)，如 果這兩種蛋白質(zhì)能夠相互結(jié)合，就會(huì)將 AD 帶到 BD 所識(shí)別結(jié)合的轉(zhuǎn)錄序列位臵上，激活下游特定報(bào)道基因的表達(dá)而被檢測(cè)。 應(yīng)用：受體 抗體作用，免疫反應(yīng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu) 缺陷： bait 有內(nèi)在 DNA 結(jié)合及激活活性時(shí) 蛋白不能穩(wěn)定表達(dá)或定位于核 蛋白不能正確折疊或后加工 (2)單雜交系統(tǒng) (onehybrid system) 分離與一個(gè)順式作用元件結(jié)合的蛋白基因 (3)三雜交系統(tǒng) (threehybrid system) 由蛋白、激酶、小分子、 RNA介導(dǎo)的 BDX與 ADY的作用 什么是酵母雜交系統(tǒng)其工作原理及特點(diǎn)。 答：體內(nèi)識(shí)別編碼與目標(biāo)蛋白租用的蛋白基因方法。酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子 (如 GAL4等 )的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和 GAL4激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。 第七章 植物基因工程 什么是 Ti 質(zhì)粒？什么是轉(zhuǎn)座子示蹤技術(shù)及其原理。 答： （ 1） Ti 是在根瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈 DNA 分子。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。 （ 2） 轉(zhuǎn)座子示 蹤技術(shù)：根據(jù)植物或細(xì)胞的表型變異進(jìn)行基因分離的有效手段。其方法是：用帶有轉(zhuǎn)座子的隱性純合植物材料與所需分離的顯性基因純系親本雜交，篩選因轉(zhuǎn)座子插入而表現(xiàn)為隱性性狀的突變品系。然后用已克隆的轉(zhuǎn)座子為探針，對(duì)突變株系進(jìn)行 Southem 分析，通過常規(guī)分子克隆 (如構(gòu)建基因文庫(kù) )分離目的基因片段。接著再以該基因片段為探針，從正常的顯性基因純系親本中克隆出相應(yīng)系列。 什么是基因挽救技術(shù)？什么是 cDNA 差異顯示技術(shù)？ 答：（ 1）有選擇壓力性狀植株 ? 基因組 ? 連入穿梭載體 ? 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 ? 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 ? 在選擇壓力 下選擇抗性植株 ? 以 TDNA 為探針選擇目標(biāo)基因 （ 2） cDNA差異顯示技術(shù)：該實(shí)驗(yàn)方法是針對(duì)從特定細(xì)胞或組織類型的 mRNA池來源的樣品用 PCR技術(shù)對(duì)其中許多的 cDNA基因一起進(jìn)行擴(kuò)增和顯示的實(shí)驗(yàn)方法。 原理：將錨定 cDNA的 3‘末端引物與隨機(jī)引物加入反應(yīng)混合液，用PCR 技術(shù)進(jìn)行雙鏈 cDNA產(chǎn)物的擴(kuò)增。過比較兩種不同細(xì)胞類型或在不同生長(zhǎng)條件下同種細(xì)胞類型來源的擴(kuò)增 cDNA產(chǎn)物的電泳帶譜，能夠用于鑒定其表達(dá)基因圖譜的差異。 植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法。 答： A 以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)化 （ 1） 土壤農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒介導(dǎo) 的遺傳轉(zhuǎn)化 長(zhǎng)度： 200~250kb 章魚堿 胭脂堿 ? 轉(zhuǎn)化載體： 共整合載體 pBR322含 Ti基因及外源基因，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，同源重組使外源基因整合于 Ti 質(zhì)粒 雙元載體系統(tǒng) 一個(gè) Ti 提供 Vir功能，另一個(gè)有目的基因、選擇標(biāo)記、移動(dòng)復(fù)制功能 ? 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)： 葉盤轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：新切的葉圓片 +農(nóng)桿菌 ? 篩選培養(yǎng)基 ? 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 ? 再生植株 （ 2） 植物 DNA 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 花椰菜花葉病毒、雀麥條斑病毒、雙子座病毒 缺點(diǎn)：外源 DNA 易被排斥、易喪失感染力、寄主范圍狹窄 B、 DNA的直接轉(zhuǎn)移法 (1)電擊法 : (2)基因槍法 ：鎢或金 ~? m (3)激光微束穿孔法 (4)顯微注射 (5)脂質(zhì)體介導(dǎo)法 (liposome) (6)多聚物介導(dǎo)法 PEG (7)花粉管通道法 第八章 基因工程研究進(jìn)展 人類基因組計(jì)劃包括哪幾方面的內(nèi)容？ 答： ○ 1 作圖 (Mapping)：將染色體或 DNA 上的標(biāo)記定位（ 14 萬個(gè)基因） 什么是遺傳連鎖圖？什么是物理圖？ 答： 遺傳連鎖圖 (geic linkage map) ：采用遺傳學(xué)分析方法（兩點(diǎn)、三點(diǎn)作圖）將基因或其他 DNA 序 列標(biāo)定在染色體上；單位 cM（厘摩 1%交換率） 物理圖 (physical map) ：有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過對(duì)構(gòu)成基因組的 DNA 分子進(jìn)行測(cè)定而繪制的。（采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將 DNA 分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際的位臵上； 1cM=1000kb(人 )； BAC庫(kù)間重疊關(guān)系） 名詞解釋： EST、 STS、 RFLP、 MS、 CpG island、 YAC、 BAC、 DNA雜交測(cè)序、芯片 答： EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）：從一個(gè)隨機(jī)選擇的 cDNA 克隆，進(jìn)行 5’端和 3’端單一次測(cè)序挑選出 來獲得的短的 cDNA 部分序列。 STS（序列標(biāo)簽位點(diǎn)）：作為基因組物理圖中位臵標(biāo)志的已知小段單拷貝獨(dú)特的 DNA 序列。 RFLP（限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性）：用同一種限制性內(nèi)切酶，完全酶切來源于同一物種不同個(gè)體的基因組 DNA，從而獲得長(zhǎng)度各異的 DNA 片段 (酶切譜 )。 MS（微衛(wèi)星）：基因組中由短的重復(fù)單元 (一般為 1～ 6個(gè)堿基 )組成的DNA 串聯(lián)重復(fù)序列。 CpG island （ CG 島，衍生作圖標(biāo)記）：基因組中穩(wěn)定的成簇的飛甲基化 GC 片段 YAC（酵母人工染色體）： YAC 人工染色體載體是利用釀酒酵母的染色體的復(fù)制 元件構(gòu)建的載體。 BAC（細(xì)菌人工染色體）：由大腸桿菌單拷貝 F質(zhì)粒衍生而成的，可用于克隆基因組大片段 DNA 及構(gòu)建基因組文庫(kù)的克隆載體。 DNA 雜交測(cè)序：運(yùn)用 DNA 分子變性后復(fù)性過程中堿基互補(bǔ)配對(duì)原理的測(cè)序法。 芯片：一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。 YAC 和 BAC 克隆體系各有怎樣的優(yōu)缺點(diǎn)？ 答： YAC：容量大。線性不穩(wěn)定、有共克隆現(xiàn)象使結(jié)果不可信。 BAC：容量大、電擊轉(zhuǎn)化、經(jīng)典篩選方法、環(huán)狀（不易被合算酶降解）、穩(wěn)定性 高（環(huán)狀、單拷貝）。 1什么是 RNAi？ RNAi 的工作原理及其特點(diǎn)。 答： RNA干涉，是由雙鏈 dsRNA介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象 ,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。 i. 高效性： 1～ 100 nmol/L的雙鏈 RNA濃度對(duì)基因沉默的效果是一致的 ii. 特異性： 21～ 23 個(gè)堿基對(duì)中有 1～ 2個(gè)堿基錯(cuò)配會(huì)大大降低對(duì)靶mRNA 的降解效果。 iii. 需要 ATP iv. 位臵效應(yīng)： siRNA對(duì) mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性， GC 含量較低的 mRNA被沉默效果較好。 v. 競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng) vi. 可傳播性系統(tǒng)性的 RNAi包括了 SID1介導(dǎo)的雙鏈 RNA在細(xì)胞間的運(yùn)輸