【正文】 iii. 需要 ATP iv. 位臵效應(yīng)： siRNA對(duì) mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性， GC 含量較低的 mRNA被沉默效果較好。 BAC：容量大、電擊轉(zhuǎn)化、經(jīng)典篩選方法、環(huán)狀（不易被合算酶降解）、穩(wěn)定性 高（環(huán)狀、單拷貝）。 DNA 雜交測(cè)序：運(yùn)用 DNA 分子變性后復(fù)性過(guò)程中堿基互補(bǔ)配對(duì)原理的測(cè)序法。 RFLP（限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性）：用同一種限制性內(nèi)切酶，完全酶切來(lái)源于同一物種不同個(gè)體的基因組 DNA，從而獲得長(zhǎng)度各異的 DNA 片段 (酶切譜 )。 植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法。接著再以該基因片段為探針，從正常的顯性基因純系親本中克隆出相應(yīng)系列。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。 答：體內(nèi)識(shí)別編碼與目標(biāo)蛋白租用的蛋白基因方法。效率低 ) 研究 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法及其原理。 (制備簡(jiǎn)單，易消毒 。 (幾乎所有類型的細(xì)胞，都可以成功地使用電穿孔技術(shù)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。 ○4 、質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)表達(dá)效率的影響 （條件致死型載體） —— 一般越多越好 ○5 、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響 終止區(qū)存在的必要性： （ 1）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外 源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； （ 2）如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； （ 3）過(guò)長(zhǎng)的 mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗 （ 4） 過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 ○6 、質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性對(duì)效率的影響 *質(zhì)粒分配由 par控制 *克隆該基因 *保持選擇壓力 *反選擇：質(zhì) 粒含 CI， 宿主是溶源化細(xì)菌，其噬菌體啟動(dòng)子缺陷 ○7 、密碼子的使用頻率 (bias)—— 密碼子的偏愛(ài)性 外源 DNA 導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法及其原理和特點(diǎn)。） ○5 、轉(zhuǎn)譯篩選法 *雜交抑制的轉(zhuǎn)譯 豐富 mRNA *雜交選擇的轉(zhuǎn)譯 低豐度 mRNAinsulin ○ 6 、正負(fù)篩選法：組織特異性、發(fā)育階段特異性、特殊處理后基因表達(dá)差異 基因組 DNA 文庫(kù)如何制備？ 基因組 DNA 文庫(kù)構(gòu)建時(shí)， 為防止外源 DNA 片段之間的連接，可采用哪些措施？ 答：（ 1）將待連接的 DNA 片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離 （ 2）用堿性磷酸單酯酶除去 DNA 片段的末端磷酸基團(tuán) （ 3）用 TdT酶在 DNA 片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 第六章基因在原核及真核體系中的表達(dá) 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)存在的問(wèn)題及其解決辦法。 答 ：（ 1）利用 RNA酶 H，以 oligo （ dT ）作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成RNADNA雜合體。Carbon 公式： N=ln(1p)/ln(1f/g) N：文庫(kù)的規(guī)模，即想要獲得某一 DNA 片段所需文庫(kù)大小。 基因組 DNA 文庫(kù)：指將某生物的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度的 DNA 片段，再與適合的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。當(dāng)外源 DNA 片段被插入在噬菌體展示載體的基因 III 編碼序列中，在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會(huì)產(chǎn)生由克隆基因與基因 III聯(lián)合編碼的融合蛋白。 什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點(diǎn)？ 答：一類由人工構(gòu)建的含有λ DNA 的 cos 序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。付產(chǎn)物少、磷酸基被保護(hù)可用硅膠柱分離、產(chǎn)率高、反應(yīng)時(shí)間短速度快 (3)亞磷酸三酯法：反應(yīng)速度快、可固相合成 原理：末端核苷（ 3’ 的第一個(gè)堿基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纖維、硅膠、微孔玻璃珠） 循環(huán)反應(yīng) 洗滌除去未反應(yīng)物和付產(chǎn)物、簡(jiǎn)化分純、加快速度 合成寡核苷酸純化方法有哪些？各有怎樣的應(yīng)用范圍和局限？ 答： 脫鹽：（乙醇沉淀、分子篩、反相柱 C18）純度低 OPC 柱純化：（ DMT）有短鏈、不適合基因合成和 DNA序列分析、不宜純 化多于 40mer的 oligo HPLC純化：吸附于反相柱的差異、用于 PCR反應(yīng)；基因合成和 DNA序列分析（較純， 40mer、 Grich不適用、設(shè)備要求高） PAGE 純化：可用于任何反應(yīng)（最純、無(wú)限制、但費(fèi)事、有毒） 寡核苷酸化學(xué)合成的實(shí)際用途？ 答：（ 1）基因合成的元件（ 2）核苷酸序列分析的引物 （ 3）核酸分子雜交的探針（ 4）突變研究 第四章噬菌體載體及粘粒 ? 噬菌體載體的類型及其比較。在 DNA 聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入 到延伸的 DNA鏈中，但由于沒(méi)有 3’羥基，不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的 DNA 鏈不能繼續(xù)延伸。（單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物）。 反向 PCR 的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的 DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成 DNA。 1什么是不對(duì)稱 PCR？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：用不等量的一對(duì)引物， PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈 DNA(SSDNA).這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為 100∶ 1。 1什么是錨定 PCR？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的 DNA。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè) PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 :610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。 PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。（ 2）高溫下脫嘌呤或脫嘧啶、而使 Taq酶不能通過(guò)（ 3）反應(yīng)添加劑、PCR循環(huán)參數(shù)、模板的完整性（模板越長(zhǎng)越不穩(wěn)定）等影響（ 4） TaqDNA聚合酶會(huì)自動(dòng)脫落。 （ 3）引物的延伸： DNA 模板 __引物結(jié)合物在 TapDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 原理 :類似于 DNA 的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核糖核苷酸引物。 連接子：指的是合成的具有限制性酶識(shí)別序列的核苷酸片段 ,利用連接子時(shí) ,將其與外源 DNA片段連接后 ,用相應(yīng)的酶切割 ,則可產(chǎn)生粘性末端。 T4DNA 連接酶的功能及其用途。 同尾酶（ isocaudomers）： 來(lái)源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。 分類： Southern 印跡雜交（ DNA）、 Northern 印跡雜交（ RNA）、斑點(diǎn)雜交（操作快，較為粗略）、原位雜交（針對(duì)總 DNA，可用于菌落、噬菌斑、組織） 2非放射性標(biāo)記物質(zhì)有什么？非放射性顯示體系是如何工作的？ 答：光促生物素標(biāo)記、酶促生物素標(biāo)記、酶促半抗原標(biāo)記、化學(xué)催化酶標(biāo)記 2掌握 II 型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特性和切割特性。 （ 3）隨機(jī)引物標(biāo)記：引物很短，僅留個(gè)堿基，這樣在引物上找到的接合位點(diǎn)多，呈現(xiàn)隨機(jī)性； DNA 聚合酶不具有從頭合成的能力，必須要有引物添加在 3’ 端羥基上，標(biāo)記出來(lái)的探針是雙鏈。 答：（ 1）切口平移：限量 DNase I 在待標(biāo)記的雙連 DNA 的每一條連上產(chǎn)生若干個(gè)單連缺口 。 答：定義：能識(shí)別特異堿基序列的有標(biāo)記的一段單鏈 DNA(或 RNA)分子，一段與被測(cè)定的核苷酸序列（靶序列）互補(bǔ)的帶標(biāo)記的單股核苷酸。 答：脈沖電場(chǎng)凝膠電泳。 （ 2）甲酰胺凝膠