【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 （ 3） GC%，所占 %比低，則 Tm 低（ 4）末端保守性：引物 3’ 端必須與模板完全匹配（ 5）兼并堿基（可用次黃嘌呤代替任意堿基） 什么是熱啟動(dòng)？ 答：指在 PCR反應(yīng)中，由于 Taq聚合酶在常溫下也具有延伸引物的活性，因此為保證擴(kuò)增產(chǎn)物的純度， PCR反應(yīng)的主要成分（模板和引物等）在延伸前才加入。 難于擴(kuò)增得到長(zhǎng)片段產(chǎn)物的原因及其解決辦法？ 答：原因：（ 1） 3’ 端得錯(cuò)配：此種情況在生物體內(nèi)也存在， 但體內(nèi)的DNA 聚合酶具有校正功能，而用于 PCR擴(kuò)增的 Taq酶不具這種功能。（ 2）高溫下脫嘌呤或脫嘧啶、而使 Taq酶不能通過(guò)（ 3）反應(yīng)添加劑、PCR循環(huán)參數(shù)、模板的完整性（模板越長(zhǎng)越不穩(wěn)定）等影響（ 4） TaqDNA聚合酶會(huì)自動(dòng)脫落。 解聚方法：發(fā)展新酶或合成能力強(qiáng)的酶； 三羥甲基甘氨酸可增加 PH穩(wěn)定性。 如何進(jìn)行 PCR 污染的控制？ 答：設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照；操作分區(qū)；材料分裝（小包裝）；加樣順序；使用專門儀器；重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 如何判斷 PCR 產(chǎn)物的特異性？ 答： PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì) 其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。 PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝膠電泳分析： PCR產(chǎn)物電泳， EB 染色紫外成像儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。 PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重 PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片段都應(yīng)符合預(yù)計(jì)的大小，這是起碼條件。 瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)在 12%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 :610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。 酶切分析：根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)， 用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測(cè) PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè) PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 Southern 印記雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與 PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè) PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。 斑點(diǎn)雜交：將 PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于 PCR 產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 核酸序列分析：是檢測(cè) PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 利用 PCR 技術(shù)如何進(jìn)行點(diǎn)突變？ 答 : DNA 分子中單個(gè)或幾個(gè)堿基的變化可以使遺傳的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 1什么是錨定 PCR？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的 DNA。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分別用多聚 dC 和已知的序列作為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 錨定 PCR（ Anchored PCR, APCR）主要用于分析具有可變末端的 DNA序列， Loh等用 APCR對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞 T細(xì)胞受體α 鏈的 mRNA的多變性進(jìn)行了分析。先可用于 T細(xì)胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。 1什么是不對(duì)稱 PCR？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：用不等量的一對(duì)引物， PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈 DNA(SSDNA).這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為 100∶ 1。 得到單鏈，更適宜測(cè)序，單鏈還可作為探針。 1什么是表達(dá)子 PCR? 應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：引入酶切位點(diǎn)，將 PCR產(chǎn)物克隆；引入噬菌體啟動(dòng)子，制備單鏈探針。 1什么是反向 PCR？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答： PCR只能擴(kuò)增兩端序列已 知的基因片段，反向 PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。 反向 PCR 的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的 DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成 DNA。 1什么是原位 PCR? 應(yīng)用于怎樣的研究？ 答：就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行 PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。原位 PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位臵，分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值。 1什么是 RAPD？應(yīng)用于怎樣的研究？ 答： RAPD 即隨即擴(kuò)增多態(tài) DNA 分析：兩個(gè)物種的個(gè)體之間，親緣關(guān)系越近其相應(yīng) PCR擴(kuò)增的帶型就越相似，繁殖差異懸殊，利用這種原理的技術(shù)成為 RAPD，應(yīng)用于生物多樣性分析。（單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物）。 第三章核酸分析與合成 末端終止法進(jìn)行 DNA 測(cè)序的原理。 答： DNA 鏈中核苷酸以 3’ ,5’ 磷酸二酯鍵連接，合成 DNA 所用的底物是 2’ 脫氧核苷三磷酸。 2’ ,3’ ddNTP與普通 dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?3’位臵缺少一個(gè)羥基。在 DNA 聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入 到延伸的 DNA鏈中，但由于沒(méi)有 3’羥基，不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的 DNA 鏈不能繼續(xù)延伸。在 DNA合成反應(yīng)混合物的 4種普通 dNTP中加入少量的一種 ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止位臵間的距離。在 4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用 4種不同的 ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生 4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的 A、 C、 G 或 T位臵。 核酸的化學(xué)合成都有哪些方法？現(xiàn)在常用的是哪種？其原理和過(guò)程是什么？ 答：（ 1）磷酸二酯法： 付產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、操作復(fù)雜 (2)磷酸三酯法 :核苷間的磷酸基以三酯存在。付產(chǎn)物少、磷酸基被保護(hù)可用硅膠柱分離、產(chǎn)率高、反應(yīng)時(shí)間短速度快 (3)亞磷酸三酯法：反應(yīng)速度快、可固相合成 原理：末端核苷（ 3’ 的第一個(gè)堿基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纖維、硅膠、微孔玻璃珠） 循環(huán)反應(yīng) 洗滌除去未反應(yīng)物和付產(chǎn)物、簡(jiǎn)化分純、加快速度 合成寡核苷酸純化方法有哪些？各有怎樣的應(yīng)用范圍和局限？ 答： 脫鹽：（乙醇沉淀、分子篩、反相柱 C18）純度低 OPC 柱純化：（ DMT）有短鏈、不適合基因合成和 DNA序列分析、不宜純 化多于 40mer的 oligo HPLC純化：吸附于反相柱的差異、用于 PCR反應(yīng)；基因合成和 DNA序列分析（較純， 40mer、 Grich不適用、設(shè)備要求高） PAGE 純化：可用于任何反應(yīng)（最純、無(wú)限制、但費(fèi)事、有毒） 寡核苷酸化學(xué)合成的實(shí)際用途？ 答：（ 1）基因合成的元件（ 2）核苷酸序列分析的引物 （ 3）核酸分子雜交的探針（ 4）突變研究 第四章噬菌體載體及粘粒 ? 噬菌體載體的類型及其比較。 答：（ 1）插入型載體 :只有一個(gè)位點(diǎn)外源基因在此插入。 （ 2） 替代性載體 :具有兩個(gè)插入位點(diǎn)兩個(gè)位點(diǎn)之間的序列在 外源基因插入后被取代。 主要區(qū)別是容量不同和插入位點(diǎn)的不同，替代性載體容量較大。 什么是柯斯質(zhì)粒載體？有怎樣的特點(diǎn)？ 答：一類由人工構(gòu)建的含有λ DNA 的 cos 序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。（容量： 31~45kb ） 特點(diǎn)： 具有 ? 噬菌體的特性（環(huán)化）； 具有質(zhì)粒載體的特性 ； 高容量 。 柯斯克隆 優(yōu)點(diǎn)：容量大、非重組體少 問(wèn)題：分子內(nèi)重組成多聚體（堿性磷酸酶處理） 基因間連接（電泳分級(jí)分離 ） 噬菌體展示載體的工作原理。 答：在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在 3