[農(nóng)學(xué)]基因工程-第三章-基因工程的載體-wenkub
2022-11-02 22:39:32 本頁(yè)面
【正文】 ?細(xì)菌質(zhì)粒載體 ?噬菌體 λ 衍生載體 ?Cosmid載體 ?Phagemid載體 ?酵母質(zhì)粒載體 ?真核病毒載體 ?Bacmid載體 ?YAC載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 發(fā)展概況 1. 第一階段（ 1977年前）： 天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二階段： 增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。 * 這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性 的（如 TcS， lacZα, GUS ），絕大多數(shù)為后者。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2. 標(biāo)記基因的種類(lèi) 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因 : Apr ， Tcr ， Cmr， Kanr， G418r，Hygr ， Neor b. 重金屬抗性基因 : Cur ， Znr ， Cd r c. 代謝抗性基因 : TK，抗除草劑基因 2） 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類(lèi)的基因， 這類(lèi)基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如 TRP1，URA3， LEU2， HIS4等。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化 β —內(nèi)酰胺環(huán)的 水解 ，使氨芐青霉素失活。來(lái)自轉(zhuǎn)座子 Tn5和Tn903的 Kanr抗性基因均可使這類(lèi)抗生素 磷酸化 ，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZα 和 β 鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 6） 葡萄糖苷酸酶基因（ GUS） 該基因編碼一種可分解各種 β 葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類(lèi) 1. 復(fù)制起點(diǎn)的種類(lèi) 1) 核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn) a. 染色體復(fù)制起點(diǎn) —原核生物 (環(huán)狀 )和真核生物 (線(xiàn)狀 )染色體 b. 染色體外復(fù)制起點(diǎn) i. 質(zhì)粒 —DNA,RNA,線(xiàn)狀 ,環(huán)狀 ,單鏈 ,雙鏈 ii. 病毒 —同上 , 細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi) 2) 核外復(fù)制起點(diǎn) a. 線(xiàn)粒體 —所有真核細(xì)胞 b. 葉綠體 —所有綠色植物細(xì)胞 原核與真核生物 兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體 1) 質(zhì)粒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自質(zhì)?；蚓€(xiàn)粒體和葉綠體 2) ARS復(fù)制型 —ARS（ autonomus replicative sequence)，或稱(chēng)染色體復(fù)制型 3) 病毒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自病毒，若為 RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因 ， 可提高藥物濃度 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 分類(lèi) 接合型 和非接合型 嚴(yán)緊性和 松弛型 在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 理想質(zhì)粒載體所具備的條件 ? 質(zhì)粒較小 ? 質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn) ? 應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ? 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： （ 1） 加入合適的選擇標(biāo)記基因 ，如兩個(gè)以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點(diǎn) ，便于重組 （ 3） 縮短長(zhǎng)度 ，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為： 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 大?。? kb ? 選擇標(biāo)記： Apr Tcr ? 單一酶切位點(diǎn)： EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠ I SalⅠ 等 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 用于組建 pBR322的 三個(gè)親本質(zhì)粒 的特征： ? pSE2124： Apr基因 ? pMB8 :Col EI松弛型復(fù)制子 ? pSC101:Tcr基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? 多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括 pUC8/9 pUC18/19 ? pUC的親本質(zhì)粒是 pBR322,包括如下四個(gè)部分： ? 來(lái)自 pBR322 的復(fù)制起點(diǎn)（ ori） ? 來(lái)自 pBR322的 Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） ? lacZ基因及其啟動(dòng)子組成 lacZ‘ 基因 ? lacZ‘ 內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS） 它含有如下單一酶切口： EcoRI、 SstI、 KpnI、 SmaI、BamHI、 XbalI、 PstI、 SphI、 HindIII。 pYAC載體具有以下特點(diǎn)： 1） 雙 TEL位點(diǎn)； 2） 三個(gè)酵母菌遺
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