【正文】 度 ? 插入型載體 ? 該類(lèi)載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度為 37kb，有單一酶切位點(diǎn)，便于外源 DNA的插入。 左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞， DNA自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負(fù)責(zé)與宿主染色體 DNA遺傳重組整合的基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 ? 天然的 l－ DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實(shí)驗(yàn)的載體 ? 1. 縮短長(zhǎng)度 野生型 l－ DNA包裝的上限為，本身長(zhǎng)度為 ，那么外源 DNA片段允許插入的大小至多為 ，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。 pYAC載體具有以下特點(diǎn)： 1） 雙 TEL位點(diǎn)； 2） 三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因； 3） 一個(gè) SUP4基因用于檢測(cè)重組子 ，其原理是： SUP4是 tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的 ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在 SUP4基因中插入外源 DNA片段后在轉(zhuǎn)化 ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征： i. 不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng) —冠癭堿 (opine)，能專(zhuān)一 的為根癌農(nóng)桿菌所利用 . 這兩個(gè)特征由 Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為： 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 大小： kb ? 選擇標(biāo)記： Apr Tcr ? 單一酶切位點(diǎn)： EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠ I SalⅠ 等 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 用于組建 pBR322的 三個(gè)親本質(zhì)粒 的特征： ? pSE2124： Apr基因 ? pMB8 :Col EI松弛型復(fù)制子 ? pSC101:Tcr基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? 多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括 pUC8/9 pUC18/19 ? pUC的親本質(zhì)粒是 pBR322,包括如下四個(gè)部分： ? 來(lái)自 pBR322 的復(fù)制起點(diǎn)（ ori） ? 來(lái)自 pBR322的 Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） ? lacZ基因及其啟動(dòng)子組成 lacZ‘ 基因 ? lacZ‘ 內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS） 它含有如下單一酶切口： EcoRI、 SstI、 KpnI、 SmaI、BamHI、 XbalI、 PstI、 SphI、 HindIII。 2. 測(cè)序質(zhì)粒 拷貝數(shù)高，加裝測(cè)定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 3. 整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上 4. 穿梭質(zhì)粒 含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制 5. 表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá) 6. 探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，他通常裝有一個(gè)可以定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 分類(lèi) 接合型 和非接合型 嚴(yán)緊性和 松弛型 在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 理想質(zhì)粒載體所具備的條件 ? 質(zhì)粒較小 ? 質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn) ? 應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ? 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： （ 1） 加入合適的選擇標(biāo)記基因 ，如兩個(gè)以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點(diǎn) ，便于重組 （ 3） 縮短長(zhǎng)度 ，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 可擴(kuò)增性 ? pMB1或 ColEI類(lèi)質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有 pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚 20213000個(gè)拷貝，這叫做 氯霉素?cái)U(kuò)增 。 如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因 ， 可提高藥物濃度 。在不同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而獲得質(zhì)粒 ds DNA或噬菌體 ss –DNA 又如：釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（ 2μ ）復(fù)制起點(diǎn)，又含有 ARS片段 b. 不同生物復(fù)制起點(diǎn)混合 —穿梭載體 （ shuttle vector） 兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)粒或病毒形式存在 * 穿梭載體范圍 ：細(xì)菌 —細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌 —酵母菌， 細(xì)菌 —真菌，細(xì)菌 —?jiǎng)游? 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)、標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 1. 復(fù)制起點(diǎn)種類(lèi)與拷貝數(shù)間的關(guān)系 1) 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：低拷貝（嚴(yán)緊型， 12 copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型， 20 copies，受宿主染色體控制較弱） 2) ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約 20 copies）