基因工程第五章-載體-文庫吧資料
2024-09-24 20:52本頁面
【正文】 2不僅易于分離純化，而且即使克隆一段大小達 6kb的外源 DNA后，其重組體分子的大小仍符合這一條件。 ?構建含有強啟動子的表達型質粒載體，很多質粒載體在多克隆位點的臨近位置上帶有外源啟動子，插入的外源基因可以表達相應的蛋白質。外源基因的插入會導致基因失活而檢查重組子。 2. 調整質粒載體的結構，引入多克隆位點： 新型載體都引入了一個人工合成的由多種常用限制性內切酶單一識別位點組成的序列，叫多克隆位點（ multiple cloning site, MCS ） 。 非必要區(qū)里存在著影響細胞性狀的基因，編碼產生特殊的物質，另外還有一部分質粒片斷至今不知其功能。 第一個經改造的認為較完善的質粒載體是pBR313, 他是松弛型載體，引入了兩個標記基因 抗四環(huán)素基因 Tecr和抗青霉素基因 Ampr, 他的外源基因插入位點在兩個抗性基因中 ? 質粒的序列含有必要區(qū)和非必要區(qū)。便于轉化、篩選。 ? 質粒的大?。和ǔＹ|粒越大，拷貝數也越少，所以我們在進行基因重組時，首先要選擇分子量小的質粒，其次質粒分子量大的要使外源基因的片斷長度合適，不要過大。 ? 質粒的拷貝數：分子的多與寡是決定產量的重要因素。 ： ? 寄主自身的遺傳背景： ? 質粒一般都保藏在質粒中，所以質粒的穩(wěn)定性直接與寄主的特性有關，我們在基因工程中采用的寄主細胞都是經過人為改造過得微生物，如 JM110，JM10 XL1Blue等，這些菌株的 end基因均發(fā)生了突變， end基因負責編碼核酸內切酶 I，突變后，菌株就失去了編碼能力，從而保證了質粒在宿主細胞中穩(wěn)定存在。用微量離心機于 4℃ 以 12022rpm離心 10分鐘。用 2倍體積的無水乙醇沉淀雙鏈DNA。 ?最后： 4℃ 12022rpm離心 10分鐘，將上清轉移到另一離心管中，上清中是質粒 DNA。蓋緊管口， 溫和 地振蕩 10秒鐘使溶液 Ⅲ 在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 3— 5分鐘。此時的現象應為變得澄清，和鼻涕一樣粘。 SDS破壞原生質體，然后 DNA變性。須使細菌沉淀在溶液 Ⅰ 中完全分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸，室溫靜止 5－ 30min，細胞壁降解。CI (pH 8． 0)， 10mmol／ L EDTA(pH 8． 0，溶菌酶 4－ 5mg，酶作用環(huán)境由緩沖液提供 )。 （ 3）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。 ?第一步：（ 1）在 5m1含相應抗生素的 LB培養(yǎng)基中接種一單菌落，于 37℃ 劇烈振蕩培養(yǎng)過夜?？截悢瞪?1－ 2個。 嚴緊型：質粒的復制的啟動，受寄主細胞的復制起始蛋白的調控，復制起始蛋白是細胞在進行 DNA復制時產生的，所以嚴緊型質粒的復制是宿主細胞進行染色體復制時才能進行復制的質粒，依賴于宿主細胞，自身不能合成復制起始蛋白。不像病毒 DNA進行無限制的合成，直到細胞裂解。這種質粒的拷貝數低。 2. cccDNA分子分離特性： ?由于 cccDNA分子團壓成一個緊密的結構，當我們用 EBr、丫啶橙染料分子作用后，線性分子染料插入的分子個數多， cccDNA插入的分子個數少，密度大，所以沉降系數大，進行密度梯度離心時可將其分開 ? cccDNA在較高高的溫度和 PH值條件下才會變性，（較線性和開放環(huán)結構的 DNA），如果變性，由于團在一起，條件恢復后，會很快復性，形成 cccDNA，線性和
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