基因工程載體bppt課件-文庫(kù)吧資料
2024-09-24 18:25本頁(yè)面
【正文】 V感染宿主后，其 DNA可以侵入植物細(xì)胞，但不插入染色體 DNA，而是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但其結(jié)果是導(dǎo)致植物的病害。? CaMV DNA的特征： 在病毒顆粒中， CaMV DNA分子以開環(huán)形式存在，兩條鏈的一定位置出現(xiàn)核苷酸序列不連續(xù)的缺口（負(fù)鏈： 1個(gè)，即 G1；正鏈： 2個(gè)，即 G2和 G3）。該病毒是為數(shù)不多的植物雙鏈 DNA病毒之一。（ 5）可直接對(duì)克隆的基因進(jìn)行核苷酸測(cè)序? CaMV(花椰菜花葉病毒 )載體系統(tǒng)：雙鏈 DNA病毒? TMV(煙草花葉病毒 )載體系統(tǒng)： 單鏈 RNA病毒? 其他植物病毒載體系統(tǒng)，如 單鏈 DNA病毒 ：番茄金黃花葉病毒、非洲木薯花葉病毒、玉米線條病毒、小麥矮縮病毒，以及 RNA病毒 ：雀麥草花葉病毒、大麥條紋花葉病毒、番茄叢矮病毒等等。構(gòu)建 M13噬菌體克隆載體的策略和途徑詳見第二版 ? 噬菌體顆粒的大小是受其 DNA的大小制約的（正好與 λ噬菌體 相反），因此它不存在包裝限制問(wèn)題。 ? 成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細(xì)胞（噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上）。RFformcosmid（ cos sitecarring plasmid）： 人工構(gòu)建的含有 λDNA 的 cos位點(diǎn) 序列和 質(zhì)粒復(fù)制子 的特殊類型的質(zhì)粒載體pHC79柯斯質(zhì)粒載體 pHC79的形體圖由 pBR322質(zhì)粒 DNA與 λ 噬菌體 DNA的 cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成部分柯斯質(zhì)粒的基本特性柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：1）具有 λ 噬菌體的特性 （但因不含全部必需基因，因此不能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）2）具有質(zhì)粒的特性 （有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）3）具有高容量的克隆能力 （本身僅 57kb, 克隆極限可達(dá) 45kb左右）4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力廣泛應(yīng)用于基因組 DNA文庫(kù)的構(gòu)建柯斯克隆 （ cosmid cloning） 理論依據(jù)：1） 在線性噬菌體 DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列 （ cos位點(diǎn) )2） 在 λ 噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè) λDNA拷貝組成的多連體分子。 剩余部分為質(zhì)粒，具有質(zhì)粒的性質(zhì)；大小約 4～ 6kb? 進(jìn)行有效包裝，插入片斷后，總大小要在 51bp之間 (允許克隆的外源 DNA片段長(zhǎng)度為 31～ 45kb)粘粒的特點(diǎn) :(1)具有 部分 λ 噬菌體 特點(diǎn) 體外包裝后，高效轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感型大腸細(xì)胞， 進(jìn)入后環(huán)化(2)具有 質(zhì)粒特點(diǎn) 復(fù)制、抗性(3)高容量克隆能力 極限可達(dá) 45kbpλ 噬菌體 包裝必備條件 :cos位點(diǎn)末端酶 (teminase)Cosmid克隆載體免疫功能失活的 （inactivatiort of immunityfunction）和 大腸桿菌 β 半乳糖苷酶失活 的 （ inactlvatlon of E．coli βgalactosidase）置換型一類在 λ 噬菌體基礎(chǔ)上改建的，在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的 DNA分子所取代的 DNA片段的克隆載體插入型載體 置換型載體 插入型載體的克隆能力置換型（取代）載體的克隆能力(2)標(biāo)記基因 噬菌斑：透明（有外源 DNA插入）和混濁 α 互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑、紅白斑 Spi ：外源 DNA取代 red、 gam基因， 能在 P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)(3)建立外包裝系統(tǒng) 轉(zhuǎn)染 (transfection)： 裸露 DNA； 由寄主細(xì)胞捕獲裸露的噬菌體 DNA的過(guò)程。線狀 λ噬菌體基因組的四個(gè)區(qū)： 左側(cè)區(qū)、中間區(qū)、右側(cè)區(qū) （調(diào)控成分、復(fù)制基因 O和 P、溶菌基因 S和 R）和 末端結(jié)構(gòu) （ λ 噬菌體的 DNA在噬菌體中是線狀 DNA分子，基因組是一長(zhǎng)約 48502bp 的雙鏈 DNA）λ 噬菌體 cos位點(diǎn)由 位于 λ 噬菌體線形雙鏈 DNA的兩端且完全互補(bǔ)的粘末端 （ 12bp）結(jié)合成的雙鏈 稱為 Cos位點(diǎn)att位點(diǎn) attL attR噬菌體插入大腸桿菌基因組方式Champbell模型λ噬菌體 DNA環(huán) 化的 λ噬菌體 DNAIntegrase 催化鏈的交換包裝限制： 離體條件下，將重組體 DNA包入噬菌體等病毒顆粒中以形成有功能的病毒載體；λ 噬菌體 頭部外殼蛋白質(zhì)容納 DNA的能力 :上限：野生型 DNA總量（ 48kb） 的 5％左右低限：野生型 DNA總量（ 48kb） 的 75％構(gòu)建 λ噬菌體的基本策略與技術(shù)路線：(1)去除 λ 噬菌體非必須區(qū)方法： 去除非必須片斷 (復(fù)制、裂解等非必須 ) 同時(shí)，抹去一些 酶切位點(diǎn)λ 噬菌體的包裝限制 : 大小 5136kb之間溶菌途徑： λ 噬菌體感染 Ecoli后，線形 λ DNA 注入細(xì)胞內(nèi)，若進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)途
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