【正文】 4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對功能的影響 : LacZ, GUS 4. 常用的遺傳標(biāo)記基因 1) 四環(huán)素抗性基因 （ Tcr） Tetracycline 可結(jié)合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2) 氨芐青霉素抗性基因 （ Apr） Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。 3) 氯霉素抗性基因 （ Cmr） Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。 4) 卡那霉素 (Kanr), 新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因 Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 5） β —半乳糖苷酶基因（ lacZ 和 lacZα ） β —半乳糖苷酶基因有 1021 AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。前者負責(zé)四聚體裝配，后者具 β —半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α 互補作用 。為 α 鏈編碼的基因稱之為 lacZα (編碼 145 AAs)。 β —半乳糖苷酶基因的優(yōu)點 : a. 酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZα 編碼 539。該標(biāo)記基因除具有上述 lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。 8） 發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。 4) 混合復(fù)制型 a. 同種生物復(fù)制起點混合 —質(zhì)粒形式存在；質(zhì)?；虿《拘问酱嬖? 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 例：大腸桿菌（ ）的 噬粒 （ phagemid）載體既含有來自質(zhì)粒的復(fù)制起點，又含有來自噬菌體（如 M13）的復(fù)制起點。 對于不同標(biāo)記基因 ， 可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù) 。 對于營養(yǎng)標(biāo)記基因 ， 可降低該基因的表達效率或更換其他低效率的標(biāo)記基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性 1. 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素 1) 復(fù)制起點類型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點 2) 標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達的標(biāo)記基因 2. 影響穩(wěn)定性的因素 1) 復(fù)制起點類型 —低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差 2) 選擇壓力 3) 載體在宿主細胞中的狀態(tài) —自主復(fù)制型和整合型 宿主細胞的遺傳特性和生理特性 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 定義 質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈 DNA分子（ Covalently closed Circular DNA, ccc DNA） 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 自主復(fù)制性 ? 質(zhì)粒 DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ ori）以及一個控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體 DNA而自主復(fù)制 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 不相容性 ? 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（ RNAI RNAII Rop因子）如果被導(dǎo)入同一細胞中，它們在復(fù)制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭 ，幾種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 攜帶遺傳標(biāo)記 ? 在實驗室中將質(zhì)粒通過物理方法導(dǎo)入受體細胞，但是即使在最佳條件下，受體細胞中也只有少數(shù)細胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進入了質(zhì)粒的受體細胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 1. 多拷貝質(zhì)粒 經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因。篩選啟動基因、終止子等。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點 ? 更小的相對分子量和更高的拷貝數(shù) ? 可用組織化學(xué)法檢測重組體 ? 具有多克隆位點（ MCS）區(qū)段 是基因工程中目前最常用的 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 1. 堿裂解法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA的緩沖液體中 （ 2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁 （ 3）加 NaOH與 SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 （ 4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體 DNA及大部分蛋白質(zhì) （ 5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶 （ 6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 （ 7）無 DNase的 RNase處理殘余 RNA 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 2. 沸水浴法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA和 Triton X100的緩沖液中 （ 2）加溶菌酶破細胞壁 （ 3）放入沸水浴中煮 40秒 （ 4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 （ 5）乙醇異丙醇沉淀 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 一、 Ti質(zhì)粒載體 1. 根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)與 Ti質(zhì)粒 G菌，可侵入 90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤 (