【正文】 * mRNA 體外翻譯（麥胚、兔網織紅細胞） * RNA 電泳 Northern Blot （ 2） cDNA兩鏈的合成 (RNA酶 H 法、自身引物法、試劑盒 ) （ 3） 雙鏈 cDNA分子與載體的連接：同聚物加尾、 inker連接子 （ 4）重組體導入宿主：轉化、轉染、電脈沖 、 cDNA 雙鏈合成過程。 p：概率，獲得某一片段的可能性。 缺點：無調節(jié)序列、低豐度 mRNA克隆難（從文庫中難以獲得） 如何計算構建文庫時的規(guī)模？其影響因素有哪些？ 答： Clerkeamp。整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。 cDNA文庫具有組織細胞特異性，比基因組 DNA 文庫小的多，從中獲得的是已經過剪接、去除內含子的 cDNA。用于構建噬菌體表面展示文庫等。 答：在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在 35個基因 III編碼的蛋白質（功能：噬菌體顆粒的正確組裝，作用于大腸桿菌雄性細胞 F性須的吸附過程）。（容量： 31~45kb ） 特點： 具有 ? 噬菌體的特性（環(huán)化）； 具有質粒載體的特性 ； 高容量 。 主要區(qū)別是容量不同和插入位點的不同，替代性載體容量較大。 答：（ 1）插入型載體 :只有一個位點外源基因在此插入。 核酸的化學合成都有哪些方法？現(xiàn)在常用的是哪種？其原理和過程是什么？ 答：（ 1）磷酸二酯法： 付產物多、產率低、操作復雜 (2)磷酸三酯法 :核苷間的磷酸基以三酯存在。在 DNA合成反應混合物的 4種普通 dNTP中加入少量的一種 ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位臵間的距離。 2’ ,3’ ddNTP與普通 dNTP不同，它們在脫氧核糖的 3’位臵缺少一個羥基。 第三章核酸分析與合成 末端終止法進行 DNA 測序的原理。 1什么是 RAPD？應用于怎樣的研究？ 答： RAPD 即隨即擴增多態(tài) DNA 分析：兩個物種的個體之間，親緣關系越近其相應 PCR擴增的帶型就越相似，繁殖差異懸殊，利用這種原理的技術成為 RAPD，應用于生物多樣性分析。 1什么是原位 PCR? 應用于怎樣的研究？ 答：就是在組織細胞里進行 PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術的優(yōu)點。 1什么是反向 PCR？應用于怎樣的研究？ 答： PCR只能擴增兩端序列已 知的基因片段，反向 PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。 得到單鏈，更適宜測序，單鏈還可作為探針。先可用于 T細胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分別用多聚 dC 和已知的序列作為引物進行 PCR擴增。 利用 PCR 技術如何進行點突變？ 答 : DNA 分子中單個或幾個堿基的變化可以使遺傳的結構發(fā)生改變。 斑點雜交：將 PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于 PCR 產物特異性鑒定及變異分析。 Southern 印記雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內部寡核苷酸）標記后做探針，與 PCR產物雜交。 酶切分析：根據(jù) PCR產物中限制性內切酶的位點， 用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。 瓊脂糖凝膠電泳：通常應在 12%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。 凝膠電泳分析： PCR產物電泳， EB 染色紫外成像儀下觀察，初步判斷產物的特異性。 如何判斷 PCR 產物的特異性？ 答： PCR產物是否為特異性擴增，其結果是否準確可靠，必須對 其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。 解聚方法：發(fā)展新酶或合成能力強的酶； 三羥甲基甘氨酸可增加 PH穩(wěn)定性。 難于擴增得到長片段產物的原因及其解決辦法？ 答：原因：（ 1） 3’ 端得錯配：此種情況在生物體內也存在， 但體內的DNA 聚合酶具有校正功能，而用于 PCR擴增的 Taq酶不具這種功能。 重復循環(huán)變性 _退火 _延伸三過程，就可獲得更多的?半保留復制鏈?。 （ 2）模板 DNA 與引物的退火：模板 DNA 經加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對接合。 PCR由變性 —— 退火 —— 延伸三個基本反應步驟構成。在體外的無細胞體系中模擬天然 DNA 復制過程的使目的 DNA 的量增加的反應。 3堿性磷酸酶、 S1 酶、 Bal31 酶、 Klenow 酶的功能及其用途是什么？ 答： 堿性磷酸酶：去磷酸化 —— 防止載體自連 S1 酶：切割單鏈 —— 末端修飾、切開回折、 RNA作圖 Bal31 酶： 5→ 3/3→ 5外切 —— 誘發(fā)基因的缺失突變、酶譜 Klenow 酶：末端放射性標記 —— DNA 聚合酶 I大片段，只是從 DNA聚合酶 I全酶中去除 5’ → 3’ 外切酶活性。） 功能： 5’ P+3’ OH 需 Mg2+ ATP 用途：（ 1）同酶或同尾酶切產物的連接（ 2）接頭與連接子的連接（ 3）末端改造后的平端連接 3什么是接頭，什么是連接子？ 答：接頭：指的是連接兩個分子或同一個分子兩末端的一段 DNA 序列，是人工合成的寡核苷酸，兩端 有限制酶識別序列。 答：（連接單位定義： 16176。 答 :星號活力（ star activity）：非標準反應條件下，內切酶識別切割能力下降，識別特異性下降 產生原因：甘油（限制性內切酶保存在甘油中）、鹽（來自于樣品，一般 可以被除去）、 PH、有機試劑（可能在粗提樣品時被加入而未除凈）；酶濃度大于 10%時會引起星號活力，故不能多加；酶質量不好也易產生星號活力。 2掌握 II 型限制性內切酶的識別特性與切割片段大小之間的關系。粘性末端分為 5’ 突出 （ 5’ 有幾個游離堿基）、 3’ 突出。什么是同尾酶？ 答：識別特性 :識別由 48個核苷酸組成的呈回文結構的特定序列。 答：原理：分子雜交是通過配對堿基對之間的非共價 鍵（主要是氫鍵）結合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。 （ 4）體外轉錄：非細胞狀態(tài)下完成轉錄，借助一定的載體及外源 DNA插入載體的克隆位點，采用合適的限制性內切酶將載體線性化，上游啟動子起始轉錄，在 RNA聚合酶的作用下以帶標記的 dNTP為底物合成新鏈。（ T4DNA聚合酶特性：在無 dNTP時，可以從任何3’ OH 外切；在四中 dNTP均存時，聚合活性占主導地位）首先在無dNTP時，用 T4DNA聚合酶作用下，序列降解產生的兩個突出的末端；然后終止加入 dNTP，有些加標記，有些不加 ，則 T4DNA聚合酶表現(xiàn)聚合作用。在 DNA 聚合酶 I的作用下 5’→ 3’ 外切，并在 5’ → 3’ 合上新底物（探針），標記一條鏈。 掌握核酸探針的標記方法及其原理。 原因：信息量豐富，不同生物含可區(qū)別的 DNA 序列，穩(wěn)定性（不像蛋白等不易保存） 特性：一般為單鏈探針：雜交速度快 /效率高，濃度高，可 進行標記，可檢測點突變。核酸探針的特性。原理：制備染色體長片段加在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小及作用時間交替變化，兩電場方向垂直， DNA分子的遷移方向隨所用的電場方向周期性變化而不斷改變。 PFGE 的原理和應用。 答：分辨力高、容量大（ 10ug）、回收片段純度高。遷移率（遷移速度）與電場強度和分子攜帶電 荷成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比（與分子的大小、極性、介質粘度有關），從而把不同分子分開 。 ？如何制備 RNA 變性凝膠？ 答：（ 1）蛋白質核酸等大分子在電場的作用下，在緩沖液中涌動的現(xiàn)象。 自然條