【導(dǎo)讀】纖維素、生物堿、乙醇等有機(jī)物，也包括一些無機(jī)化學(xué)品，甚至某些礦石。計(jì)，然后按設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系。入受體細(xì)胞，并使之增殖和表達(dá)的技術(shù)。增殖，從而獲得大量相同的重組DNA分子，或者外源基因表達(dá)獲得大量的蛋白質(zhì)。切割的，基因是可以轉(zhuǎn)移重組的，基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。質(zhì)產(chǎn)物的分離純化。性內(nèi)切酶和DNA連接酶等工具酶，使DNA分子進(jìn)行體外切割和連接，即體外重組成為可能。育出許多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)了許多生物藥品。載體同外源DNA在體外重。列內(nèi)，這種序列常常被稱之為多克隆位點(diǎn)區(qū)。分重要的功能，即指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子，篩選標(biāo)記基因?；虻鞍踪|(zhì)，有的也可用于cDNA文庫(kù)的建立。發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒分子的存在。

　　

【正文】 結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為 DNA 提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。 1 在轉(zhuǎn)化過程中容易污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，故同時(shí)做幾種對(duì)照： DNA 對(duì)照：用無菌水代替感受態(tài)細(xì)胞；感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照：用無菌 NTE 代替 DNA 溶液；感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照：用已知容易轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 作陽性對(duì)照。 1 電穿孔轉(zhuǎn)化法：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源 DNA 的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源 DNA 濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μ gDNA 可以得到 109～ 1010 轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率會(huì)提高，但同時(shí)導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的下降，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的組合導(dǎo)致 50％～ 70％細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。 1 細(xì)胞的處理：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的大腸桿菌，離心，用低鹽的緩沖液充分洗離心， 然后用 10％甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為 3 1010 個(gè) /ml，分裝，在干冰速凍，－ 70℃儲(chǔ)存。在 0～ 4℃進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，體積 20～ 40μ l。 1 重組噬菌體 DNA 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌：將重組噬菌體導(dǎo)入受體細(xì)胞過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。將重組噬菌體 DNA 分子，先經(jīng)體外包裝系統(tǒng)，形成噬菌體顆粒，而重新具有自然感染受體細(xì)胞的能力，從而將其導(dǎo)入受體細(xì)胞。 1 體外包裝是指在體外模擬噬菌體 DNA 分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體 DNA 分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。 1 大腸桿菌的選擇：突變株作為受體 細(xì)胞；通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株；主要依據(jù)所用載體的要求。 1 重組噬菌體 DNA 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌遺傳性狀改造：限制與修飾系統(tǒng)（ hsd R）；重組系統(tǒng)（ rec）；易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo) LamB 膜蛋白；有明顯的選擇性差異，選擇性互補(bǔ)的遺傳標(biāo)記； 感染寄生缺陷型。 轉(zhuǎn)化率：是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)。定義：每微克載體 DNA 在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)；或者每微克載體 DNA 轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納 DNA 的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)。轉(zhuǎn)化率是指 DNA 分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的 效率；影響轉(zhuǎn)化率的因素很多，一般從重組DNA 分子、受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化手段三方面加以考慮。 2 重組 DNA 分子導(dǎo)入植物細(xì)胞：⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法；（羥基乙酰丁香酸）⑵ DNA 直接轉(zhuǎn)移法。 2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法：用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為外植體；一般從以下幾個(gè)方面選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體：①優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等材料；②幼年期外植體；③轉(zhuǎn)化的外植體易培養(yǎng)，并有較強(qiáng)的再生能力④注意易被轉(zhuǎn)化的分生組織感受態(tài)細(xì)胞所在的部位及其數(shù)量。 2 DNA 的直接轉(zhuǎn)移法：物理方法：電穿孔法，基因槍法，激光微束穿孔法 ，顯微注射法；化學(xué)方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法；生物方法：花粉管通道法。 2 重組 DNA 分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：病毒顆粒轉(zhuǎn)染法，磷酸鈣轉(zhuǎn)導(dǎo)法，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，電穿孔法，顯微注射技術(shù)。 第二章 ：克隆子的篩選與鑒定 重組子：目的基因與克隆載體結(jié)合。 克隆子：重組子成功進(jìn)入宿主細(xì)胞并表達(dá)。 篩選陽性克隆：（ 1）針對(duì)克隆子遺傳表型改變的初步篩選法：抗生素平板篩選、利用 lacZ基因設(shè)計(jì)的藍(lán)白斑篩選；（ 2）分析重組子結(jié)構(gòu)特征的進(jìn)一步篩選法：內(nèi)切酶圖譜分析、 PCR 核酸雜交；（ 3）分析克隆子表達(dá)產(chǎn)物的篩選方法：免疫化學(xué)檢測(cè)法、轉(zhuǎn)譯 篩選法、基因表達(dá)產(chǎn)物分析法；（ 4）陽性克隆子的終極鑒定：核酸序列測(cè)定、蛋白質(zhì)序列分析。 遺傳表型直接篩選法：轉(zhuǎn)化處理后的菌液適量涂布在選擇培養(yǎng)基上，在最適生長(zhǎng)溫度條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察菌落生長(zhǎng)情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。篩選方法：抗藥性篩選，營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選，顯色互補(bǔ)篩選。 抗藥性篩選：氨芐青霉素（ Amp）：含 bla 基因的菌體能轉(zhuǎn)譯β－丙酰胺酶，降解 Ap。氯霉素：含 cat 基因的菌體能轉(zhuǎn)譯氯霉素乙酰轉(zhuǎn)?；?，使 Cm 乙酰化而失效?？敲顾兀汉琄an 抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾 Kn 的酶，阻礙 Kn 對(duì)核糖體的干擾。鏈霉 素：含 Str 抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾 Sm 的酶，抑制 Sm 與核糖體的結(jié)合。四環(huán)素（ Tet）：含 Tc 抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能改變細(xì)菌膜的蛋白，防止 Tc 進(jìn)入細(xì)胞后干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。 pBR322 質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因 : Tetr 和 Ampr； Tetr 上有插入位點(diǎn) BamH I 和 Sal I。 Ampr 上有插入位點(diǎn) Pst I。 利用 lacZ 基因設(shè)計(jì)的藍(lán)白斑篩選法 ： 1 lacZ 基因：編碼β 半乳糖苷酶； 2 宿主菌是突變株 ,其 lacZ△ M15 基因：表達(dá)β 半乳糖苷酶的 C 端肽段； 3 質(zhì)粒 lacZ’基因：β 半乳糖苷酶N 端肽段（α肽）； 4 在 IPTG 誘導(dǎo)下， lacz’ 基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的β 半乳糖苷酶 N 端肽， 與受體菌表達(dá)的β 半乳糖苷酶的 C 端肽互補(bǔ)而具有β 半乳糖苷酶活性（稱為α 互補(bǔ)）； 5 半乳糖苷酶水解 Xgal 而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色； 6 當(dāng)外來序列插入后則破壞了 lacz ’編碼的半乳糖苷酶活性，生長(zhǎng)的菌落就呈白色。 利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞：在植物轉(zhuǎn)基因研究中，載體攜帶的選擇標(biāo)記基因經(jīng)常稱報(bào)告基因。常用的報(bào)告基因有：抗生素抗性基因，編碼某些酶的基因，編碼特殊產(chǎn)物的基因。①新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、②潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 基因、③熒光素酶基因、④抗除草劑bar 基因。 利用遺傳標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、胸腺核苷激酶基因 （ tk）、二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）、黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。 胸苷激酶基因：胸苷激酶（ TK）能夠把胸苷轉(zhuǎn)化胸苷磷酸，保證核苷酸順利合成。一般是 HAT 選擇法。 1 HAT 選擇法 ：氨基蝶呤阻斷細(xì)胞核苷酸的全程合成，啟動(dòng)以次黃嘌呤為底物的補(bǔ)救合成途徑，該途徑不受氨基蝶呤的抑制。 氨基喋啉（ A） 的抑制作用：氨甲喋啉是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷 dATP、 dCTP 和 dTTP 的合成； 次黃嘌呤（ H）的補(bǔ)救作用：細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成 dATP 和 dCTP； 胸苷酸激酶（ T） 的補(bǔ)救作用： TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（ T）合成 TTP，存活。 1 二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）：二氫葉酸可通過 dhfr 轉(zhuǎn)化為四氫葉酸。真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。對(duì)于 dhfr－突變受體細(xì)胞，由于它不能合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，因此不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；不過，如果在常規(guī)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸苷，則突變體細(xì)胞可以借助核苷酸的補(bǔ)救合成途徑維持生長(zhǎng) 。對(duì)于 dhfr+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸；能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)法：①?gòu)浹a(bǔ)缺陷：轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。②增加新性狀：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 1 形成嗜菌斑篩選法：噬菌體載體，外源 DNA 與噬菌體載體重組后，只有重組 DNA 分子的大小在野生型λ噬菌體 DNA 長(zhǎng)度的 78％～ 105％范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基平板上形成噬菌斑，而非轉(zhuǎn)化子為正常菌落。 1 限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析 法：程序：①挑取一個(gè)菌落，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；②取菌液，提取質(zhì)粒；③用合適的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)；④瓊脂糖電泳分析。 1 利用 PCR 方法篩選確定重組子： PCR 能在模板序列上擴(kuò)增出目的 DNA 片斷。在載體 DNA分子中，外源 DNA 插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列多為固定已知的，把已知兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列作為引物，就可以對(duì)重組子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，來鑒定。 PCR 法程序：①挑取待鑒定的菌落；②加入重組 PCR 鑒定試劑；③瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 1 核酸分子雜交檢測(cè)鑒定：利用插入的外源 DNA 分子，作為探針，來鑒定重組子。 1 核酸分子雜交： Southern 印 跡雜交， Northern 印跡雜交，斑點(diǎn)印跡雜交或狹縫印跡雜交。 1 Southern blotting：用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) DNA 樣品。從宿主細(xì)胞中提取 DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。 Northern blotting：用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) RNA 樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取 RNA，再用探針雜交。 2 R環(huán)檢測(cè)法：用目的基因的 mRNA 與重組載體雜交。在 70%甲酰胺中，把 DNA 雙鏈變性，復(fù)性的時(shí)候， DNARNA 雜 交分子比 DNADNA 雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種 R環(huán)形結(jié)構(gòu)。 2 免疫學(xué)方法檢測(cè)克隆子：對(duì)于表達(dá)載體，陽性克隆子，可表達(dá)出外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，我們可以用相應(yīng)的抗體，來檢測(cè)陽性克隆。其程序與菌落原位雜交類似，只是用抗體來代替DNA 探針。 2 菌落原位 western blotting 程序：①將菌落或嗜菌斑影印到 NC 等固相支持物上；②用氯仿飽和氣體裂解菌落；③進(jìn)行第一抗體反應(yīng)；特異抗體④進(jìn)行第二抗體反應(yīng)；種特異性抗體或 A 蛋白；⑤放射自顯影或酶標(biāo)顯色反應(yīng)。 2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ ELISA）：一抗：與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二 抗：與一抗的特異性結(jié)合。酶連：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。 2 免疫印跡（ western blotting）法：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。① SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳；②凝膠中的蛋白質(zhì)染色：直接染色、轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。 2 陽性重組子的終極鑒定：（ 1）核酸序列測(cè)定：化學(xué)降解測(cè)序法，雙脫氧鏈終止法；（ 2）蛋白質(zhì)序列分析。 2 基因工程： 獲得目的基因；選擇載體；基因重組；重組子導(dǎo)入 宿主細(xì)胞；陽性克隆子的篩選與鑒定；目的基因的擴(kuò)增、表達(dá) 第二章 ：目的基因的制備 目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。 基因的組成：有表達(dá)功能的基因：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，核糖體識(shí)別區(qū)，編碼區(qū)（起始密碼、開讀框、終止密碼），轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。 SD 區(qū)：原核 mRNA 的起始密碼子 AUG 上游 10 區(qū)有一段可與核糖體結(jié)合、富含嘌呤的 39個(gè)核苷酸的共同序列，一般為“ ...AGGAGGU...”，稱為 SD 序列。該結(jié)構(gòu)與結(jié)合于核糖體 30S小亞基上的 16SrRNA 的 3’端序列“? UCCUCCA?”互補(bǔ)， 成為 16SrRNA 識(shí)別、結(jié)合 mRNA的位置，核糖體由此位置向前移動(dòng)，尋找 mRNA 的起始密碼子 AUG。 真核生物基因組成：?jiǎn)雾樂醋樱换蜷g有很長(zhǎng)的間隔序列；基因內(nèi)有內(nèi)含子、外顯子；TATA box 20~30； CAAT box 75； GC； 3’端 ? AAUAAA?， poly A 裝接信號(hào)。 目的基因的制備：直接分離法，構(gòu)建基因組文庫(kù)法，構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)法， PCR 擴(kuò)增法，基因的化學(xué)合成。 直接分離法：限制性內(nèi)切酶法，物理和化學(xué)方法分離，雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因，逆轉(zhuǎn)錄酶直接從特定 mRNA 分離基因。 構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法：提取基因組 DNA，擴(kuò)增所有基因，克隆篩選。 基因組文庫(kù)：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌的群體之中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫(kù)。 構(gòu)建基因組文庫(kù)：根據(jù)載體不同分：λ噬菌體基因組文庫(kù)， Cosmid 基因組文庫(kù)， YAC 基因組文庫(kù) cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種 cDNA片段與克隆載體重組，存儲(chǔ)在一種宿主菌群體中，這樣的群體稱為 cDNA 文庫(kù)。 1 基因文庫(kù)的完備性：定義：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率。它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù) N 之間的關(guān)系可用下式 表示 N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )， P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率， f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 1 基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克??；克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。 1 cDNA 第一鏈的合成 ： 1 cDNA 第二鏈的合成 ：①自身引導(dǎo)法 ：獲得的雙鏈 cDNA 5’端會(huì)有 幾對(duì)堿基缺失，②置換合成法：獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失，③引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列。 1 雙鏈 cDNA 的克?。弘p鏈平頭的 cDNA 通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收。平頭兩端分別接同