【正文】 ed repeats, IR）1kb左右的編碼區(qū)，它僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。復(fù)合轉(zhuǎn)座子（posite transposon）復(fù)合轉(zhuǎn)座子是由兩個(gè)重復(fù)序列夾著一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因如某些抗藥性基因和其它基因組成。存在于R因子及其它質(zhì)粒中。復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩端的組件由IS和類IS組成。DNA轉(zhuǎn)座的一般模式轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。果蠅轉(zhuǎn)座元件Copia 反轉(zhuǎn)座子；FB 家族；★P 元件P 因子P因子全長2 907 bp，兩端有31bp的反向重復(fù)序列。4個(gè)編碼區(qū)、3個(gè)內(nèi)含子。體細(xì)胞中，只有內(nèi)含子2被順利切除，產(chǎn)生前3個(gè)外顯子的功能型 mRNA，被翻譯成66KD的轉(zhuǎn)座阻遏蛋白——一種轉(zhuǎn)座活性的抑制因子。生殖細(xì)胞中，內(nèi)含子3被切除，產(chǎn)生的成熟mRNA包括全部4個(gè)外顯子并被翻譯成87KD的轉(zhuǎn)座酶，才能導(dǎo)致P因子轉(zhuǎn)座和配子不育。 P元件介導(dǎo)的果蠅雜交不育的原因：P元件在染色體ω遺傳位點(diǎn)的插入往往會(huì)導(dǎo)致不育，這是由于很多的P因子發(fā)生轉(zhuǎn)座，造成插入突變。含有P因子的雌果蠅與無論是否帶有P因子的雄果蠅雜交，由于P細(xì)胞型的存在抑制了轉(zhuǎn)座酶的合成或激活，表現(xiàn)出正常的生育能力。但當(dāng)雌果蠅為M型時(shí)，在卵中無阻遏物，這樣導(dǎo)致了來自雄果蠅生殖細(xì)胞中的P因子轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)座酶。桿狀病毒1）桿狀病毒科分為包涵體桿狀病毒和非包涵體桿狀病毒2）宿主僅限于無脊椎動(dòng)物3）桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子4）桿狀病毒基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄5）雙相生活史第一時(shí)相：時(shí)間：感染后的024小時(shí)。結(jié)果：產(chǎn)生大量的BV，出芽釋放，在蟲體內(nèi)傳播第二時(shí)相：時(shí)間：感染24小時(shí)以后。結(jié)果：形成大量的ODV，被多角體蛋白包裹，最終形成多角體，經(jīng)口感染其它宿主。桿狀病毒高效表達(dá)系統(tǒng)1) 病毒基因組較大,可以插入相當(dāng)大的外源DNA片段2)常采用多角體蛋白基因啟動(dòng)子（polhP）3）常采取轉(zhuǎn)移載體與野生病毒體內(nèi)重組方式構(gòu)建重組病毒4) 重組病毒多角體蛋白基因的編碼區(qū)被外源基因取代，喪失形成包涵體功能5）可以家蠶或昆蟲細(xì)胞作表達(dá)宿主優(yōu)缺點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工系統(tǒng)接近于哺乳動(dòng)物，表達(dá)水平高，但生產(chǎn)成本高。桿狀病毒表達(dá)外源基因流程亞克隆目的基因與桿粒進(jìn)行重組從大腸桿菌中分離重組桿粒，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞分離重組病毒用于基因表達(dá)第七章 高等動(dòng)物基因工程高等動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等動(dòng)物基因工程高等動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等動(dòng)物基因工程技術(shù)動(dòng)物工程動(dòng)物工程細(xì)胞細(xì)胞蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體哺乳動(dòng)哺乳動(dòng)物遺傳性狀改良生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白物遺傳性狀改良 基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子質(zhì)粒復(fù)合物法生物學(xué)方法——?jiǎng)游锊《据d體：腺病毒、 SV腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。人腺病毒DNA載體1)雙鏈環(huán)狀DNA病毒2)腺病毒感染人體細(xì)胞是裂解型，不致癌3)腺病毒可感染處于分裂期或非分裂期的細(xì)胞4)不整合入基因組缺點(diǎn)：免疫原性強(qiáng)、不能持久表達(dá)外源蛋白SV40 DNA載體（雙鏈環(huán)狀DNA）基因表達(dá)好 外源基因能高效表達(dá)基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小反轉(zhuǎn)錄病毒（單鏈RNA病毒）優(yōu)點(diǎn)：A、宿主范圍廣（幾乎所有類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞）B、效率高，可以感染大量的細(xì)胞，通常一次可以感染106～107細(xì)胞C、外源DNA在整合時(shí)不發(fā)生重排，單位點(diǎn)、低拷貝整合（一般不超過5個(gè)）缺點(diǎn)：A、只感染分裂細(xì)胞B、攜帶外源基因的長度有限(8kb)C、載體病毒基因有潛在的致病性，如存在載體與人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）序列間發(fā)生D、重組而產(chǎn)生有感染能力的人逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在危險(xiǎn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指用實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入的方法將外源基因在染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達(dá)和遺傳的一類動(dòng)物（包括基因敲除的動(dòng)物）。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)：是指借助基因工程技術(shù)將體外重組的結(jié)構(gòu)基因?qū)胧芫鸦蛟缙谂咛ィ嘤鲛D(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法一、受精卵雄原核顯微注射法二、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法：所得到的動(dòng)物為嵌合體動(dòng)物三、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法四、體細(xì)胞核移植法五、精子載體法六、YAC法動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器：是基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái),使外源基因?qū)雱?dòng)物基因組中并定位表達(dá)于動(dòng)物乳腺,利用動(dòng)物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在動(dòng)物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價(jià)值產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的總稱。乳腺生物反應(yīng)器的原理 是應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù), 得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)的個(gè)體。外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū),即需要一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列, 這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下,使其在乳腺中表達(dá),再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。常用的啟動(dòng)子理論上講任何乳蛋白基因的調(diào)控序列都能驅(qū)動(dòng)外源基因在乳腺組織特異表達(dá)。綿羊的球蛋白啟動(dòng)子(βlactoglobulin ,BLG)酪蛋白啟動(dòng)子：目前常用小鼠、山羊和牛的酪蛋白啟動(dòng)子乳清酸蛋白（WAP）啟動(dòng)子：常用的有小鼠和兔的WAP啟動(dòng)子哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞能以懸浮培養(yǎng)或在無血清的培養(yǎng)基中達(dá)到高密度且培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L 以上缺點(diǎn)：A、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)水平低B、高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建復(fù)雜C、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝復(fù)雜D、哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物的成本較高CHO表達(dá)系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary Cell)—CHO是目前最成功的生物制品表達(dá)宿主細(xì)胞。目前常用的CHO 細(xì)胞包括原始CHO 和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(dhfr ) 突變株CHO在表達(dá)基因工程蛋白藥物時(shí)人們往往首選CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，至今批準(zhǔn)的由動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，其宿主幾乎都是CHO細(xì)胞。CHO的優(yōu)缺點(diǎn)①具有準(zhǔn)確完善的翻譯后修飾功能,表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子②具有完善的產(chǎn)物胞外分泌功能,便于下游產(chǎn)物分離純化③具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力④能以懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度, 且培養(yǎng)體積能達(dá)到1 000 L以上⑤CHO 細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞,很少分泌自身的內(nèi)源蛋白,利于外源蛋白的后分離缺點(diǎn)：CHO 細(xì)胞培養(yǎng)成本高,條件難掌握,易污染,在一定程度上影響了它的廣泛應(yīng)用。CHO系統(tǒng)高效表達(dá)的策略載體改造轉(zhuǎn)錄前水平：增加基因拷貝數(shù)、優(yōu)化整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平：強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子轉(zhuǎn)錄后水平：強(qiáng)Poly A信號(hào)元件、使用內(nèi)含子翻譯水平：Kozak序列、通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES表達(dá)多亞基蛋白、通過翻譯增強(qiáng)子提高翻譯效率基因改造：采用偏愛密碼子，盡量采用基因組DNA宿主改造：改善細(xì)胞的工程性能基因治療基因治療： 指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。 遺傳性疾病、腫瘤、艾滋病、心血管病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫疾病和內(nèi)分泌疾病等?；蛑委煼诸愐弧⒛康幕?qū)塍w內(nèi)的方式 體外途徑(ex vivo)－間接法， 回輸法 體內(nèi)途徑(in vivo)－直接法二、靶細(xì)胞 體細(xì)胞：疾病相關(guān)細(xì)胞，免疫系統(tǒng)細(xì)胞，干細(xì)胞 生殖細(xì)胞：嚴(yán)格禁止基因疫苗基因疫苗： 基因免疫過程中所使用的核酸表達(dá)載體，又稱核酸疫苗?；蛎庖撸? 則指將編碼外源性抗原的基因克隆到合適的表達(dá)載體上，再將重組載體以一定的方式導(dǎo)入宿主體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程。第八章高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)高等植物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植株植株植物工程細(xì)胞農(nóng)作物遺農(nóng)作物遺傳性狀改良傳性狀改良蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)小分子化合小分子化合物大規(guī)模生產(chǎn)物大規(guī)模生產(chǎn)概念：Ti質(zhì)粒：是在根瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子，它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。Ti是英文腫瘤誘發(fā)（tumorinducing）的縮略式。TDNA（transferred DNA regions）：是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒或者Ri質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。第九章 蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程的基本概念：通過基因水平的操作對(duì)功能蛋白或多態(tài)進(jìn)行改進(jìn)，從而得到新的結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)的技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)的兩大主要途徑：A、基因的體外定點(diǎn)突變：利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外試管中可以通過堿基取代、插入或缺失使基因DNA序列中任何一個(gè)特定的堿基或片段發(fā)生改變B、體外分子定向進(jìn)化：以暗箱方式模擬自然進(jìn)化過程基礎(chǔ)上。分子定向進(jìn)化所需要的兩大必要條件是構(gòu)建隨機(jī)突變的基因文庫和對(duì)突變文庫的高通量篩選系統(tǒng)（蛋白質(zhì)工程研究的活躍領(lǐng)域） 常用定點(diǎn)突變方法： PCR法（引物中直接引入突變） 定向突變：最常用 建立突變庫：隨機(jī)突變技術(shù)、易錯(cuò)PCR、DNA改組技術(shù)等 高通量篩選：噬菌體展示、核糖體展示技術(shù)等注意：（1）若有缺漏，請(qǐng)根據(jù)老師講的重點(diǎn)進(jìn)行復(fù)習(xí)（2）資料僅供參考