【正文】 ed repeats, IR）1kb左右的編碼區(qū)，它僅編碼和轉座有關的轉座酶。復合轉座子（posite transposon）復合轉座子是由兩個重復序列夾著一個或多個結構基因如某些抗藥性基因和其它基因組成。存在于R因子及其它質(zhì)粒中。復合轉座子兩端的組件由IS和類IS組成。DNA轉座的一般模式轉座可被分為復制性和非復制性兩大類。在復制性轉座中，所移動和轉位的是原轉座子的拷貝。轉座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉座子和復制轉座子。TnA類轉座主要是這種形式。在非復制性轉座中，原始轉座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉座。果蠅轉座元件Copia 反轉座子；FB 家族；★P 元件P 因子P因子全長2 907 bp，兩端有31bp的反向重復序列。4個編碼區(qū)、3個內(nèi)含子。體細胞中，只有內(nèi)含子2被順利切除，產(chǎn)生前3個外顯子的功能型 mRNA，被翻譯成66KD的轉座阻遏蛋白——一種轉座活性的抑制因子。生殖細胞中，內(nèi)含子3被切除，產(chǎn)生的成熟mRNA包括全部4個外顯子并被翻譯成87KD的轉座酶，才能導致P因子轉座和配子不育。 P元件介導的果蠅雜交不育的原因：P元件在染色體ω遺傳位點的插入往往會導致不育，這是由于很多的P因子發(fā)生轉座，造成插入突變。含有P因子的雌果蠅與無論是否帶有P因子的雄果蠅雜交，由于P細胞型的存在抑制了轉座酶的合成或激活，表現(xiàn)出正常的生育能力。但當雌果蠅為M型時，在卵中無阻遏物，這樣導致了來自雄果蠅生殖細胞中的P因子轉錄為轉座酶。桿狀病毒1）桿狀病毒科分為包涵體桿狀病毒和非包涵體桿狀病毒2）宿主僅限于無脊椎動物3）桿狀病毒的基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子4）桿狀病毒基因組可在昆蟲細胞核復制和轉錄5）雙相生活史第一時相：時間：感染后的024小時。結果：產(chǎn)生大量的BV，出芽釋放，在蟲體內(nèi)傳播第二時相：時間：感染24小時以后。結果：形成大量的ODV，被多角體蛋白包裹，最終形成多角體，經(jīng)口感染其它宿主。桿狀病毒高效表達系統(tǒng)1) 病毒基因組較大,可以插入相當大的外源DNA片段2)常采用多角體蛋白基因啟動子（polhP）3）常采取轉移載體與野生病毒體內(nèi)重組方式構建重組病毒4) 重組病毒多角體蛋白基因的編碼區(qū)被外源基因取代，喪失形成包涵體功能5）可以家蠶或昆蟲細胞作表達宿主優(yōu)缺點：表達產(chǎn)物的修飾加工系統(tǒng)接近于哺乳動物，表達水平高，但生產(chǎn)成本高。桿狀病毒表達外源基因流程亞克隆目的基因與桿粒進行重組從大腸桿菌中分離重組桿粒，轉染昆蟲細胞分離重組病毒用于基因表達第七章 高等動物基因工程高等動物細胞基因表達技術高等動物基因工程高等動物細胞基因表達技術高等動物基因工程技術動物工程動物工程細胞細胞蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)轉基因動物個體哺乳動哺乳動物遺傳性狀改良生物反應器大量生產(chǎn)有價值的蛋白物遺傳性狀改良 基因導入細胞內(nèi)的方法物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子質(zhì)粒復合物法生物學方法——動物病毒載體：腺病毒、 SV腺相關病毒、反轉錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。人腺病毒DNA載體1)雙鏈環(huán)狀DNA病毒2)腺病毒感染人體細胞是裂解型，不致癌3)腺病毒可感染處于分裂期或非分裂期的細胞4)不整合入基因組缺點：免疫原性強、不能持久表達外源蛋白SV40 DNA載體（雙鏈環(huán)狀DNA）基因表達好 外源基因能高效表達基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄 只能轉染猴細胞裝載量較小反轉錄病毒（單鏈RNA病毒）優(yōu)點：A、宿主范圍廣（幾乎所有類型哺乳動物細胞）B、效率高，可以感染大量的細胞，通常一次可以感染106～107細胞C、外源DNA在整合時不發(fā)生重排，單位點、低拷貝整合（一般不超過5個）缺點：A、只感染分裂細胞B、攜帶外源基因的長度有限(8kb)C、載體病毒基因有潛在的致病性，如存在載體與人內(nèi)源性逆轉錄病毒（HERV）序列間發(fā)生D、重組而產(chǎn)生有感染能力的人逆轉錄病毒的潛在危險動物轉基因技術轉基因動物：是指用實驗導入的方法將外源基因在染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達和遺傳的一類動物（包括基因敲除的動物）。轉基因動物技術：是指借助基因工程技術將體外重組的結構基因導入受精卵或早期胚胎，培育出轉基因動物的技術。轉基因動物的制作方法一、受精卵雄原核顯微注射法二、胚胎干細胞（ES細胞）法：所得到的動物為嵌合體動物三、逆轉錄病毒感染法四、體細胞核移植法五、精子載體法六、YAC法動物乳腺生物反應器乳腺生物反應器：是基于轉基因技術平臺,使外源基因導入動物基因組中并定位表達于動物乳腺,利用動物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在動物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價值產(chǎn)品的轉基因動物的總稱。乳腺生物反應器的原理 是應用重組DNA技術和轉基因技術, 得到轉基因乳腺表達的個體。外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調(diào)控區(qū),即需要一個引導泌乳期乳蛋白基因表達的序列, 這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下,使其在乳腺中表達,再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。常用的啟動子理論上講任何乳蛋白基因的調(diào)控序列都能驅動外源基因在乳腺組織特異表達。綿羊的球蛋白啟動子(βlactoglobulin ,BLG)酪蛋白啟動子：目前常用小鼠、山羊和牛的酪蛋白啟動子乳清酸蛋白（WAP）啟動子：常用的有小鼠和兔的WAP啟動子哺乳動物細胞表達系統(tǒng)優(yōu)點：目的基因在哺乳動物細胞中表達的蛋白與天然蛋白的結構、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白哺乳動物細胞能以懸浮培養(yǎng)或在無血清的培養(yǎng)基中達到高密度且培養(yǎng)體積能達到1000L 以上缺點：A、哺乳動物細胞的表達水平低B、高表達細胞株構建復雜C、細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝復雜D、哺乳動物細胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物的成本較高CHO表達系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell)—CHO是目前最成功的生物制品表達宿主細胞。目前常用的CHO 細胞包括原始CHO 和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型(dhfr ) 突變株CHO在表達基因工程蛋白藥物時人們往往首選CHO 細胞表達系統(tǒng)，至今批準的由動物細胞表達的產(chǎn)品，其宿主幾乎都是CHO細胞。CHO的優(yōu)缺點①具有準確完善的翻譯后修飾功能,表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子②具有完善的產(chǎn)物胞外分泌功能,便于下游產(chǎn)物分離純化③具有重組基因的高效擴增和表達能力④能以懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度, 且培養(yǎng)體積能達到1 000 L以上⑤CHO 細胞屬于成纖維細胞,很少分泌自身的內(nèi)源蛋白,利于外源蛋白的后分離缺點：CHO 細胞培養(yǎng)成本高,條件難掌握,易污染,在一定程度上影響了它的廣泛應用。CHO系統(tǒng)高效表達的策略載體改造轉錄前水平：增加基因拷貝數(shù)、優(yōu)化整合位點轉錄水平：強啟動子、增強子、終止子轉錄后水平：強Poly A信號元件、使用內(nèi)含子翻譯水平：Kozak序列、通過內(nèi)部核糖體進入位點IRES表達多亞基蛋白、通過翻譯增強子提高翻譯效率基因改造：采用偏愛密碼子，盡量采用基因組DNA宿主改造：改善細胞的工程性能基因治療基因治療： 指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的生物醫(yī)學新技術。 遺傳性疾病、腫瘤、艾滋病、心血管病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫疾病和內(nèi)分泌疾病等?；蛑委煼诸愐?、目的基因導入體內(nèi)的方式 體外途徑(ex vivo)－間接法， 回輸法 體內(nèi)途徑(in vivo)－直接法二、靶細胞 體細胞：疾病相關細胞，免疫系統(tǒng)細胞，干細胞 生殖細胞：嚴格禁止基因疫苗基因疫苗： 基因免疫過程中所使用的核酸表達載體，又稱核酸疫苗?；蛎庖撸? 則指將編碼外源性抗原的基因克隆到合適的表達載體上，再將重組載體以一定的方式導入宿主體內(nèi)，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產(chǎn)生免疫應答的過程。第八章高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物細胞基因表達技術高等植物轉基因技術高等植物細胞基因表達技術高等植物轉基因技術轉基因轉基因植株植株植物工程細胞農(nóng)作物遺農(nóng)作物遺傳性狀改良傳性狀改良蛋白多肽物質(zhì)蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)大規(guī)模生產(chǎn)小分子化合小分子化合物大規(guī)模生產(chǎn)物大規(guī)模生產(chǎn)概念：Ti質(zhì)粒：是在根瘤土壤桿菌細胞中存在的一種染色體外自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子，它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。Ti是英文腫瘤誘發(fā)（tumorinducing）的縮略式。TDNA（transferred DNA regions）：是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒或者Ri質(zhì)粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉移DNA。第九章 蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程的基本概念：通過基因水平的操作對功能蛋白或多態(tài)進行改進，從而得到新的結構與功能的蛋白質(zhì)的技術。 蛋白質(zhì)工程改造蛋白質(zhì)的兩大主要途徑：A、基因的體外定點突變：利用分子生物學技術，在體外試管中可以通過堿基取代、插入或缺失使基因DNA序列中任何一個特定的堿基或片段發(fā)生改變B、體外分子定向進化：以暗箱方式模擬自然進化過程基礎上。分子定向進化所需要的兩大必要條件是構建隨機突變的基因文庫和對突變文庫的高通量篩選系統(tǒng)（蛋白質(zhì)工程研究的活躍領域） 常用定點突變方法： PCR法（引物中直接引入突變） 定向突變：最常用 建立突變庫：隨機突變技術、易錯PCR、DNA改組技術等 高通量篩選：噬菌體展示、核糖體展示技術等注意：（1）若有缺漏，請根據(jù)老師講的重點進行復習（2）資料僅供參考