【正文】 基鏈上都含100個以上的甘露糖，是正常的十幾倍。這種過度糖基化可能會引起副反應。(4)表達菌株傳代不穩(wěn)定，表達質粒易丟失。（5）分泌效率低，大于30kD的蛋白質幾乎不分泌。畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源基因具有以下優(yōu)點：(1)它所具有的AOX1啟動子是一種強有力的啟動子，受甲醇嚴格誘導調控而表達，所以可嚴格調控外源蛋白的表達；(2)由于它可以對表達蛋白進行糖基化、蛋白磷酸化、折疊、信號序列加工、脂類酰化等一系列的翻譯后修飾，從而使其表達的蛋白具有生物活性；(3)表達量高，迄今為止，已有300多種異源蛋白在該表達系統(tǒng)中獲得了高效表達，如破傷風毒素片段C可達12g/L，已有報道其胞內表達量甚至達到了22g/L；(4)外源基因的表達產物既可存在于胞內，又可通過其特有的信號肽a因子或天然蛋白本身的信號肽分泌至細胞外，同時，該系統(tǒng)自身分泌的蛋白非常少，這大大簡化了純化過程，如表達的重組水蛭素（HIR），僅經過二步層析純化就可達到97％以上的純度；(5) 表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合，整合入外源基因的重組子表達系統(tǒng)十分穩(wěn)定。有文獻報道通過同源重組整合入外源基因的重組子表達系統(tǒng)可連續(xù)培養(yǎng)50代卻未見外源基因丟失的現(xiàn)象；(6)糖基化程度低，畢赤酵母中加到外源蛋白每條側鏈的平均長度為8~14個甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側鏈平均50~150甘露糖殘基要短得多，同時，由于畢赤酵母不能象釀酒酵母那樣在核心多糖末端形成a1,3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性遠遠低于后者。因而更適合于治療用途；(7)畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用；(8)該表達系統(tǒng)由于對營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成份簡單廉價，可進行高密度高產量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產。但是畢赤酵母表達系統(tǒng)也有其缺點：（1）分子生物學的研究基礎差，要對其進行遺傳改造較困難。（2）發(fā)酵周期較長。（3）不是食品微生物，發(fā)酵時要添加甲醇，所以要用它來生產藥品或食品還無法被廣泛接受。5 提高外源基因在酵母中的表達水平，考慮從哪些方面入手？答：為提高外源基因在酵母中的表達水平，可以考慮從以下方面入手：一、轉錄水平控制外源基因在酵母中的表達和基因的轉錄水平有密切的關系，篩選高效的啟動子就顯得十分重要，強啟動子還可以表達多種基因。二、表達載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性表達載體在細胞中的拷貝數(shù)對外源基因在酵母中的表達有明顯的影響。釀酒酵母和其他一些酵母有多拷貝的內源質粒，以這類質粒為基礎可以建成高拷貝質粒表達載體。三、其他因素還有一些因素應該考慮，其中包括采取提高翻譯效率的措施，如：優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結構，在外源基因中盡量選用酵母偏愛的密碼子等；避免表達產物在細胞內的降解；選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主；優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝，如：提高發(fā)酵密度、控制發(fā)酵階段和發(fā)酵時間等等。四、酵母表達系統(tǒng)的新的應用方向近年來，酵母表達系統(tǒng)除了用來高效表達外源基因，獲得基因工程產品外，還開辟了一些新的應用方向。（1）．用于人類基因組研究。（2）．用于分析蛋白質相互作用。（3）．用于蛋白質、藥物、抗體等的快速篩選。 第九章 1動物細胞表達系統(tǒng)中常用的表達載體有哪些？答案：根據(jù)載體進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質粒載體。其中病毒載體有逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒載體等。質粒載體又分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復制能力，需整合于宿主細胞染色體內方能穩(wěn)定存在；而附加體型載體則是在細胞內以染色體外可自我復制的附加體形式存在。2 HAT篩選方法的原理是什么？答案：在胸苷激酶基因(tk)表型缺陷型(tk)細胞培養(yǎng)中，如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(A)處理細胞，二氫葉酸還原酶被抑制，不能使二氫葉酸還原成四氫葉酸，其結果是培養(yǎng)基中的四氫葉酸因得不到補充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成過程均被阻斷。次黃嘌呤是dATP和dACP補救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中含有這種物質時，細胞就能越過氨基蝶呤的抑制作用，利用補救途徑繼續(xù)合成出這些核苷酸。同時由于在HAT培養(yǎng)基中含有外源的胸苷(T)，所以tk+細胞通過胸苷激酶的作用合成TTP，繼續(xù)存活下去；而tk細胞因缺乏胸苷激酶而不發(fā)生這種合成，因而死亡。如將正常的tk基因導人tk細胞，這些細胞能夠存活下去，所以使用HAT培養(yǎng)基，能夠選擇出經tk基因轉化的tk細胞。3 簡述脂質體轉染法的原理？答案：脂質體（liposome encapsulation）是由天然脂類和類固醇組成的微球，根據(jù)其結構所包含的雙層膜層數(shù)可分為單室脂質體和多室脂質體，含有1層類脂雙分子層的囊泡稱單室脂質體，含有多層類脂雙分子層的囊泡稱為多室脂質體。脂質體轉染法可能的機理是陽離子脂質體與帶負電的基因依靠靜電作用形成脂質體基因復合物，該復合物因陽離子脂質體的過剩正電荷而帶正電，借助靜電作用吸附于帶負電的細胞表面，再通過與細胞膜融合或細胞內吞作用而進入細胞內，脂質體基因復合物在細胞質中可能進一步傳遞到細胞核內釋放基因，并在細胞內獲得表達。4什么是轉基因動物？答案：轉基因動物是指由于外源DNA導入（包括同一物種的DNA）動物的基因組而產生了可以遺傳的改變的動物。這些可以遺傳的改變包括：外源DNA 片段至少整合到一條染色體的一個位點上；外源DNA的插入使基因組中任何一個基因的結構發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導入可以持久存在的遺傳實體，例如，一條人工染色體或者可以自我復制并傳遞給子細胞的非染色體DNA元件。5顯微注射法制備轉基因動物的主要過程是什么？答案：顯微注射法建立轉基因動物的過程至少涉及以下四個主要步驟：① 構建外源基因表達載體并生產用于注射的DNA 溶液；②準備供注射用的胚胎并制定顯現(xiàn)原核的技術方案；③實施顯微注射并將注射后的胚胎進行相應的技術處理，然后移植到受體母畜中；④對出生的幼畜進行基因整合和表達的檢測，把篩選出來的轉基因動物繁殖傳代培育，進而建立轉基因動物的家系和群體。6 外源基因整合到宿主染色體上時，其構型有什么特點？答案：在一個特定的胚胎或一個特定細胞克隆中，外源基因總是整合在染色體的單一位點，最多整合在少數(shù)幾個位點上，且在每個整合位點，外源基因通常呈現(xiàn)多拷貝串狀結構，采取頭尾相連的排列方式。只有在稀有的情況下，外源基因的兩個拷貝呈現(xiàn)頭對頭或尾對尾的連結方式，在這種情況下常發(fā)生末端缺失。第十章 ？植物遺傳轉化，又稱轉基因或植物基因工程，其研究的關鍵是利用重組DNA、細胞組織培養(yǎng)或種質系統(tǒng)轉化等技術，將外源基因導入植物細胞或組織，使之定向重組遺傳物質，改良植物性狀，培育優(yōu)質高產作物新品種(王關林等，1998)。自1983年首例轉基因植株誕生，天然植物基因工程開始在人工控制下定向改良植物的遺傳性狀。與常規(guī)育種方法相比，它具有以下一些特點：①不受親緣關系的限制，可實現(xiàn)動物、植物和微生物間遺傳物質的交流，從而充分利用自然界存在的各種遺傳資源；②有效地打破有利基因和不利基因的連鎖，充分利用有用基因；③加快育種進程，縮短育種年限。2. 世界上哪年獲得第一株轉基因植物？哪年發(fā)明基因槍？水稻哪年轉化成功？1983年，第一株轉基因植株(Zambryski，1983)的獲得標志著植物轉基因時代的到來。 1987年，Cornell大學的Sanford等發(fā)明了基因槍，同年Klein首次將其用于植物轉基因研究，克服了當時農桿菌介導的轉基因方法的受體種類和基因型的限制，開創(chuàng)了植物轉基因方法新領域。1994年，Hiei等通過使用農桿菌侵染誘導劑乙酰丁香酮(AS)以及構建VirG和VirB高效表達的超雙元載體，高效成功地轉化了水稻。3. 解釋報告基因和標記基因？標記基因可分為選擇基因(selective gene)和報告基因(reporter gene)，二者都可以看做是標記基因，都起著標記目的基因是否成功轉化的作用，但是它們又有著各自的特點。選擇基因（又稱選擇標記基因），主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因（如nptⅡ基因和bar基因），這種基因在執(zhí)行其選擇功能時，通常存在檢測慢（蛋白酶作用需要時間）、依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）等缺陷。而報告基因則是指其編碼產物能夠被快速測定、且不依賴于外界壓力的一類基因。理想的報告基因通常具備如下基本要求：①、受體細胞中不存在相應內源等位基因的活性；②、它的產物是唯一的，且不會損害受體細胞；③、具有快速、廉價、靈敏、定量和可重復性的檢測特性。目前常用的報告基因有氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）、熒光素酶基因（luc）、β葡萄糖苷酸酶基因（gus）、冠癭堿合成酶基因（nos）等。下面介紹常用標記基因的檢測方法。4. 植物基因工程載體種類？何為雙元載體?具備那些特點？ 章魚堿型 Ti 質粒 胭脂堿型 農桿堿型農桿菌素堿型 質粒載體 農桿堿型Ri質粒 甘露堿 黃瓜堿型 植物基因工程載體 單鏈RNA病毒 植物病毒載體 單鏈DNA病毒 雙鏈DNA病毒 轉座子載體農桿菌二元載體系統(tǒng)(binarysystem)：農桿菌基因轉移的必不可少的功能元件是由T DNA本身和Ti質粒分別提供的，這兩種組分可分別裝載在兩個載體上時，這種方法叫二元載體系統(tǒng)。二元載體含有TDNA切割和整合所必需的25bp邊界序列。TDNA上的植物激素基因可去掉，以便為所要轉進植物細胞的外來DNA的插入留下空間；同時，除去植物激素基因也可防止受體細胞的非控制生長。其他不可缺少的基因為Ti質粒上的vir基因，這些基因若裝載在另一質粒(稱作輔助質粒)上，則可起到反式作用。（Resistant gene）是目前使用的最廣泛的選擇標記，常用的抗生素抗性有哪幾種？并舉兩例說明其原理？ 氨芐青霉素抗性基因ampr 、 四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr 、 卡那霉 素和新霉素抗性基因kanr ①氨芐青霉素抗性基因ampr: 青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質區(qū)，抑制轉肽反應并催化β內酰胺環(huán)水解（水解青霉素），從而解除了氨芐青霉素的毒性。 ②四環(huán)素抗性基因tetr： 四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。6. 講述農桿菌介導轉基因的主要步驟？合適外植體的選擇及再生系統(tǒng)的建立抗生素篩選壓的確定及農桿菌菌株的選擇葉盤(或其他外植體)預培養(yǎng)(1～5天，非必須) 農桿菌侵染(數(shù)秒、分鐘) 共培養(yǎng)(2—3 天) 推遲篩選或篩選(培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和選擇抗生素) 抗性芽的獲得選擇抗生素(如Km)中生根轉基因植株的獲得分子生物學檢測？基因槍(particle gun)介導轉化法又稱微彈轟擊法(microprojectile bombardment, particlebombardment, biolistic)，是指利用火藥爆炸、高壓氣體和高壓放電作為驅動力(這一加速設備稱為基因槍)，將載有目的基因的金屬顆粒加速，高速射入植物組織和細胞中，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出新的植株。微粒上的外源DNA進人細胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉化?；驑屴D化的基本步驟如下：① 受體細胞或組織的準備和預處理；② DNA微彈的制備；③ 受體材料的轟擊；④ 轟擊后外植體的培養(yǎng)和篩選。？ CaCl對DNA有沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有黏附作用，將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上。