【正文】 生但卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭(zhēng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于從引物3’末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。第二類是不依賴于PCR的定點(diǎn)誘變方法，包括盒式誘變、寡核苷酸介導(dǎo)的誘變和Kunkel法1試述利用重疊延伸PCR 法進(jìn)行定點(diǎn)突變的基本過程。一步重疊延伸PCR法，其原理是首先將待突變的DNA 以相反的方向克隆到兩個(gè)載體中，這兩個(gè)載體除了多克隆位點(diǎn)相反外其余均相同，這樣便得到兩個(gè)模板。③原核生物的基因表達(dá)是以操縱子為單位的。⑦在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)翻譯起始密碼子及同16S rRNA 3162。鏈霉菌：①鏈霉菌為非致病菌，使用比較安全；②不產(chǎn)生內(nèi)毒素；③表達(dá)產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外；④可進(jìn)行高密度培養(yǎng)；⑤具有豐富的次生代謝途徑和初級(jí)、次生代謝調(diào)控系統(tǒng)；⑥發(fā)酵技術(shù)成熟。4. 外源基因在原核生物中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)的存在形式有哪些？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？① 包涵體表達(dá)：優(yōu)點(diǎn)：包涵體的形成有利于防止宿主蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解。外源蛋白以融合蛋白的方式表達(dá)時(shí)易于分離分離純化，可根據(jù)受體菌蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，利用受體菌蛋白的特異性抗體、配體或底物親和層析等技術(shù)分離純化融合蛋白，然后通過蛋白酶水解或化學(xué)法特異性裂解受體菌蛋白與外源蛋白之間的肽鍵，獲得純化的外源蛋白產(chǎn)物。分批培養(yǎng)：這是最傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，即向發(fā)酵罐內(nèi)一次性投入培養(yǎng)基并接種培養(yǎng)，一次性放料的間歇式培養(yǎng)方法。然后，以恒定的速度開始進(jìn)料和出料，控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：解決了傳統(tǒng)發(fā)酵方法中因乙酸等代謝副產(chǎn)物的過高積累而限制工程菌的生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)的問題。8. 分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的過程一般包括哪些步驟？各有哪些細(xì)節(jié)需要注意？ 一般都包括對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理、回收菌體、細(xì)胞破碎、離心分離、樣品的濃縮與預(yù)處理、柱層析和電泳等步驟。④ 離心分離：高速離心的離心力一般在10000g的范圍以內(nèi)，主要用來(lái)去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片等。⑦ 電泳：蛋白質(zhì)電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。溶解包涵體的試劑包括變性劑（如尿素、鹽酸胍）和去垢劑（如Triton、SDS）等。缺點(diǎn)：用于沉淀的試劑需要額外的純化步驟來(lái)去除，有時(shí)它們甚至對(duì)重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有不利的影響，在基因工程產(chǎn)物濃縮中并不被廣泛采用?？梢院芊奖愕貞?yīng)用于各種重組蛋白質(zhì)的濃縮和純化。②遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。⑥有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。pYES2每個(gè)元件的功能: 2μori: 酵母細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)，URA3：酵母細(xì)胞尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記；Amp：氨芐青霉素抗性篩選標(biāo)記；PUC ori: 大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；CYCTT：CYC基因加尾信號(hào)；Pgal1 ：gal基因啟動(dòng)子；f1 ori: f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中有其他碳源時(shí)，AOX1 mRNA是檢測(cè)不到的。4 釀酒酵母和畢氏酵母表達(dá)載體中常用的啟動(dòng)子有哪些？哪些是誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子？哪些是組成型的啟動(dòng)子？答：釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1，PHO5，CUP1等，巴氏畢赤酵母啟動(dòng)子AOX1。（2）釀酒酵母生長(zhǎng)迅速，工藝簡(jiǎn)單，成本低。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)也有不足之處：（1）發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會(huì)影響酵母本身的生長(zhǎng)，因此較難進(jìn)行高密度發(fā)酵，直接導(dǎo)致表達(dá)外源基因很難達(dá)到很高的水平；(2)釀酒酵母缺乏強(qiáng)有力的受嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，分泌的蛋白質(zhì)能力較差；（3）對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化修飾不夠理想：和高等真核生物的相比所形成的糖基側(cè)鏈太長(zhǎng)，發(fā)生超糖基化，每個(gè)N糖基鏈上都含100個(gè)以上的甘露糖，是正常的十幾倍。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)它所具有的AOX1啟動(dòng)子是一種強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)調(diào)控而表達(dá)，所以可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；(2)由于它可以對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行糖基化、蛋白磷酸化、折疊、信號(hào)序列加工、脂類酰化等一系列的翻譯后修飾，從而使其表達(dá)的蛋白具有生物活性；(3)表達(dá)量高，迄今為止，已有300多種異源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)，如破傷風(fēng)毒素片段C可達(dá)12g/L，已有報(bào)道其胞內(nèi)表達(dá)量甚至達(dá)到了22g/L；(4)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物既可存在于胞內(nèi)，又可通過其特有的信號(hào)肽a因子或天然蛋白本身的信號(hào)肽分泌至細(xì)胞外，同時(shí)，該系統(tǒng)自身分泌的蛋白非常少，這大大簡(jiǎn)化了純化過程，如表達(dá)的重組水蛭素（HIR），僅經(jīng)過二步層析純化就可達(dá)到97％以上的純度；(5) 表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合，整合入外源基因的重組子表達(dá)系統(tǒng)十分穩(wěn)定。（2）發(fā)酵周期較長(zhǎng)。釀酒酵母和其他一些酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒，以這類質(zhì)粒為基礎(chǔ)可以建成高拷貝質(zhì)粒表達(dá)載體。（2）．用于分析蛋白質(zhì)相互作用。質(zhì)粒載體又分為整合型和附加體型載體兩類。同時(shí)由于在HAT培養(yǎng)基中含有外源的胸苷(T)，所以tk+細(xì)胞通過胸苷激酶的作用合成TTP，繼續(xù)存活下去；而tk細(xì)胞因缺乏胸苷激酶而不發(fā)生這種合成，因而死亡。4什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物？答案：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指由于外源DNA導(dǎo)入（包括同一物種的DNA）動(dòng)物的基因組而產(chǎn)生了可以遺傳的改變的動(dòng)物。只有在稀有的情況下，外源基因的兩個(gè)拷貝呈現(xiàn)頭對(duì)頭或尾對(duì)尾的連結(jié)方式，在這種情況下常發(fā)生末端缺失。2. 世界上哪年獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物？哪年發(fā)明基因槍？水稻哪年轉(zhuǎn)化成功？1983年，第一株轉(zhuǎn)基因植株(Zambryski，1983)的獲得標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因時(shí)代的到來(lái)。選擇基因（又稱選擇標(biāo)記基因），主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因（如nptⅡ基因和bar基因），這種基因在執(zhí)行其選擇功能時(shí)，通常存在檢測(cè)慢（蛋白酶作用需要時(shí)間）、依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）等缺陷。下面介紹常用標(biāo)記基因的檢測(cè)方法。其他不可缺少的基因?yàn)門i質(zhì)粒上的vir基因，這些基因若裝載在另一質(zhì)粒(稱作輔助質(zhì)粒)上，則可起到反式作用。 ①氨芐青霉素抗性基因ampr: 青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。四環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由399個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。？ CaCl對(duì)DNA有沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有黏附作用，將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上。微粒上的外源DNA進(jìn)人細(xì)胞后，整合到植物染色體上，得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。 ②四環(huán)素抗性基因tetr：二元載體含有TDNA切割和整合所必需的25bp邊界序列。理想的報(bào)告基因通常具備如下基本要求：①、受體細(xì)胞中不存在相應(yīng)內(nèi)源等位基因的活性；②、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞；③、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測(cè)特性。1994年，Hiei等通過使用農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)以及構(gòu)建VirG和VirB高效表達(dá)的超雙元載體，高效成功地轉(zhuǎn)化了水稻。自1983年首例轉(zhuǎn)基因植株誕生，天然植物基因工程開始在人工控制下定向改良植物的遺傳性狀。5顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要過程是什么？答案：顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過程至少涉及以下四個(gè)主要步驟：① 構(gòu)建外源基因表達(dá)載體并生產(chǎn)用于注射的DNA 溶液；②準(zhǔn)備供注射用的胚胎并制定顯現(xiàn)原核的技術(shù)方案；③實(shí)施顯微注射并將注射后的胚胎進(jìn)行相應(yīng)的技術(shù)處理，然后移植到受體母畜中；④對(duì)出生的幼畜進(jìn)行基因整合和表達(dá)的檢測(cè)，把篩選出來(lái)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖傳代培育，進(jìn)而建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的家系和群體。3 簡(jiǎn)述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的原理？答案：脂質(zhì)體（liposome encapsulation）是由天然脂類和類固醇組成的微球，根據(jù)其結(jié)構(gòu)所包含的雙層膜層數(shù)可分為單室脂質(zhì)體和多室脂質(zhì)體，含有1層類脂雙分子層的囊泡稱單室脂質(zhì)體，含有多層類脂雙分子層的囊泡稱為多室脂質(zhì)體。2 HAT篩選方法的原理是什么？答案：在胸苷激酶基因(tk)表型缺陷型(tk)細(xì)胞培養(yǎng)中，如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(A)處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶被抑制，不能使二氫葉酸還原成四氫葉酸，其結(jié)果是培養(yǎng)基中的四氫葉酸因得不到補(bǔ)充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成過程均被阻斷。 第九章 1動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中常用的表達(dá)載體有哪些？答案：根據(jù)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。四、酵母表達(dá)系統(tǒng)的新的應(yīng)用方向近年來(lái)，酵母表達(dá)系統(tǒng)除了用來(lái)高效表達(dá)外源基因，獲得基因工程產(chǎn)品外，還開辟了一些新的應(yīng)用方向。5 提高外源基因在酵母中的表達(dá)水平，考慮從哪些方面入手？答：為提高外源基因在酵母中的表達(dá)水平，可以考慮從以下方面入手：一、轉(zhuǎn)錄水平控制外源基因在酵母中的表達(dá)和基因的轉(zhuǎn)錄水平有密切的關(guān)系，篩選高效的啟動(dòng)子就顯得十分重要，強(qiáng)啟動(dòng)子還可以表達(dá)多種基因。因而更適合于治療用途；(7)畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用；(8)該表達(dá)系統(tǒng)由于對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成份簡(jiǎn)單廉價(jià)，可進(jìn)行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。(4)表達(dá)菌株傳代不穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易丟失。（4）表達(dá)產(chǎn)物可分泌表達(dá)，易于純化。4 比較釀酒酵母和畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。當(dāng)AOX1基因缺失時(shí)，AOX2存在時(shí)，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細(xì)胞利用甲醇能力降低。細(xì)胞中乙醇氧化酶的活力大多數(shù)是由AOX1提供的。答：穿梭表達(dá)載體是由來(lái)自酵母的部分核酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個(gè)部分主要是作為在大腸桿菌宿主時(shí)增殖和篩選組分。④培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。11. 重組質(zhì)粒發(fā)生逃逸的原因有哪些？① 重組質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，造成受體菌種所含的重組質(zhì)粒拷貝數(shù)存在差異；② 來(lái)自受體細(xì)胞的遺傳影響；③ 重組質(zhì)粒所攜帶的外源基因過度表達(dá)，抑制了受體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，以致原來(lái)體系中數(shù)目極少的不含重組質(zhì)粒的菌體經(jīng)過若干代繁殖后在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)；④ 重組質(zhì)粒因種種原因被受體細(xì)胞分泌運(yùn)輸至胞外，這種情況多發(fā)生在細(xì)菌處于高溫或含表面活性劑（如SDS）、某些藥物(如利福平）以及染料（如吖啶類）的環(huán)境中。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需加入任何化學(xué)試劑，不發(fā)生相變化，能耗低，而且不引起溫度、pH值變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。10. 對(duì)分泌型蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮有哪些策略？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？濃縮方法包括沉淀法、超濾法、吸附/洗脫層析等。該電泳純的樣品可用來(lái)進(jìn)行氨基酸序列分析、免疫學(xué)分析和醫(yī)學(xué)研究等。⑤ 柱層析：根據(jù)蛋白質(zhì)的不同用途，需要對(duì)表達(dá)的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。② 細(xì)胞分離：通過原核細(xì)胞培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液，無(wú)論目標(biāo)蛋白位于細(xì)胞內(nèi)還是被分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，首先都應(yīng)該將細(xì)胞與培養(yǎng)液進(jìn)行分離，一般通過離心沉降或者過濾的方式進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)：可以大大提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性，而且對(duì)分泌型表達(dá)的工程菌發(fā)酵更為有利，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。故將工程菌的生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。缺點(diǎn)：有的基因工程菌在穩(wěn)定生長(zhǎng)期會(huì)產(chǎn)生大量蛋白酶，降解外源基因表達(dá)產(chǎn)物。另外基于環(huán)境安全的考慮，發(fā)酵操作中一般要防止基因工程菌在自然界的擴(kuò)散，因此，發(fā)酵罐排出的氣體或排出的液體均要經(jīng)過滅菌處理。② 分泌型表達(dá)： 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解的幾率；通過對(duì)分泌表達(dá)的設(shè)計(jì)有利于形成正確的空間構(gòu)象，獲得有較好生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。3. 什么是RBS？RBS在基因表達(dá)中有何作用？ RBS，即核糖體結(jié)合位點(diǎn)，是指緊靠啟動(dòng)子下游的，從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸幾十個(gè)堿基長(zhǎng)度的一段序列，翻譯起始密碼子AUG通常位于它的中心位置，是核糖體RNA識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)。2. 原核表達(dá)系統(tǒng)中，常用的受體菌有哪些？各有什么特點(diǎn)？用于原核表達(dá)系統(tǒng)的常用宿主菌有：大腸桿菌，芽孢桿菌、鏈霉菌和藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）等。⑤原核細(xì)胞中缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，因此目的基因不能用真核生物的基因組DNA，而應(yīng)該用cDNA。第七章1. 與真核生物相比，原核生物基因表達(dá)有什么特點(diǎn)？與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)的基因表達(dá)具有以下特點(diǎn)：①大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)生物，具有生長(zhǎng)快，代謝易于控制的特點(diǎn)，可通過發(fā)酵迅速獲得大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。該兩條雙鏈DNA片段經(jīng)變性和退火，形成兩種異源雙鏈分子，其中具有3180。1對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法有哪些？DNA定點(diǎn)突變的方法分為兩大類。 三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長(zhǎng)的DNA鏈中，但由于沒有339。二、菌落原位雜交法1試述Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序的基本原理。再加入1mL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。1簡(jiǎn)述氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化的基本過程。（6）選擇蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，以利于穩(wěn)定大量收集目的蛋白產(chǎn)物。（2）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞要方便。同樣地，如果兩組tester cDNA與接頭的連接效率不同，也將丟失一些差異表達(dá)cDNA；有時(shí)會(huì)產(chǎn)生嵌合cDNA（幾率為2%）。（3）速度快，效率高：一次SSH反應(yīng)可以同時(shí)分離幾十或成百個(gè)差