【正文】 起點，在宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制。這個啟動子是由trp啟動子的–35區(qū)、lacUV5啟動子的–10區(qū)、操縱基因及SD序列組成。利用二元載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時，首先要將外源基因構(gòu)建到微型Ti質(zhì)粒上，再將微型Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有輔助Ti質(zhì)粒的土壤農(nóng)癌桿菌菌株中，用該菌株侵染植物組織，含目的基因的TDNA可整合到植物基因組中。（4）連接介導(dǎo)的PCR，在只知道DNA一端的序列的情況下，能夠?qū)ξ粗囊欢诵蛄羞M(jìn)行測序和對體內(nèi)甲基化圖譜或DNA印跡進(jìn)行分析。OH 及堿環(huán)上的氨基等由于受到保護(hù)而不會參與反應(yīng)；（3）亞磷酸三酯經(jīng)碘氧化形成磷酸三酯；（4）加入二氯乙酸除去生長鏈中的539。（3）起始材料需要 mg 級量mRNA；SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度。取100μL菌液涂布于篩選平板上, 先正面向上放置，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃過夜培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。凹末端的雙鏈分子，在用兩個外側(cè)寡核苷酸引物進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增時，可產(chǎn)生出一種突變位點遠(yuǎn)離片段末端的突變體DNA。作用：SD序列是翻譯起始密碼子（AUG）上游513個核苷酸處的一段富含嘌呤UAAGGAGGU的全部或者其中的一部分序列，在翻譯起始階段與核糖體小亞基16S rRNA的3’端相互作用，以正確定位起始密碼子。透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。9. 怎樣對包涵體進(jìn)行溶解和復(fù)性？ 包涵體的溶解一般是通過變性實現(xiàn)的，目的是將蛋白產(chǎn)物變成一種可溶的形式以利于分離純化。⑤有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。答：釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有很多優(yōu)點（1）釀酒酵母長期廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)，不產(chǎn)生毒素，安全性好，已被美國FDA認(rèn)定為安全性生物，其表達(dá)產(chǎn)物不需經(jīng)過大量宿主安全性實驗。二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性表達(dá)載體在細(xì)胞中的拷貝數(shù)對外源基因在酵母中的表達(dá)有明顯的影響。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可能的機(jī)理是陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的基因依靠靜電作用形成脂質(zhì)體基因復(fù)合物，該復(fù)合物因陽離子脂質(zhì)體的過剩正電荷而帶正電，借助靜電作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)胞表面，再通過與細(xì)胞膜融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，脂質(zhì)體基因復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中可能進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞核內(nèi)釋放基因，并在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。目前常用的報告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、熒光素酶基因（luc）、β葡萄糖苷酸酶基因（gus）、冠癭堿合成酶基因（nos）等。四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。 3. 解釋報告基因和標(biāo)記基因？標(biāo)記基因可分為選擇基因(selective gene)和報告基因(reporter gene)，二者都可以看做是標(biāo)記基因，都起著標(biāo)記目的基因是否成功轉(zhuǎn)化的作用，但是它們又有著各自的特點。次黃嘌呤是dATP和dACP補(bǔ)救合成途徑的一種底物，培養(yǎng)基中含有這種物質(zhì)時，細(xì)胞就能越過氨基蝶呤的抑制作用，利用補(bǔ)救途徑繼續(xù)合成出這些核苷酸。但是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)也有其缺點：（1）分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對其進(jìn)行遺傳改造較困難。細(xì)胞在甲醇上生長緩慢，這種表型的菌株被稱為Muts(methanol utilization slow ) , AOX1基因存在時，細(xì)胞利用甲醇能力正常，在含甲醇的培養(yǎng)基生長快，這種表型的菌株被稱為Mut＋(methanol utilization plus)，當(dāng)兩者都缺乏時，細(xì)胞無法利用甲醇，這種表型的菌株被稱為Mut型。12. 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的有哪些途徑？ ①改進(jìn)載體宿主系統(tǒng)；②壓力選擇法；③控制外源基因過量表達(dá)；④優(yōu)化培養(yǎng)條件；⑤采用固定化技術(shù)；第八章1 對作為表達(dá)目標(biāo)蛋白宿主的酵母細(xì)胞有什么基本要求？答：對作為表達(dá)目標(biāo)蛋白宿主的酵母細(xì)胞的基本要求是①安全無毒，沒有致病性。⑥ 親和層析：是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗原與抗體、受體與激素、酶與底物或抑制劑、操縱基因與阻遏蛋白、凝集素與糖類以及核酸與有關(guān)蛋白之間的結(jié)合。連續(xù)培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，先培養(yǎng)一段時間，使菌體細(xì)胞濃度和產(chǎn)物濃度達(dá)到一定的要求。大腸桿菌：遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚，已有大量可供選用的表達(dá)載體等特點芽孢桿菌：①芽孢桿菌是非致病微生物，比較安全；②培養(yǎng)條件簡單，易于控制；③生長迅速，周期短；④表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中；⑤多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性；⑥某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，且利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。第一類是基于PCR的點突變，包括重疊延伸PCR 法、大引物PCR 法、特殊位置堿基的定點突變和擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒全長的突變。感受態(tài)細(xì)胞的制備取貯存的大腸桿菌菌種，平板劃線，培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于35ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；將該菌液以1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)23小時至OD600=；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入用冰預(yù)冷的離心管中，冰浴1020分鐘，低溫離心收集菌體，棄去上清； ，冰浴1530分鐘，低溫離心收集菌體；， EP管中，每管100μL，加入20%的甘油，70℃貯存?zhèn)溆?。?）實驗結(jié)果復(fù)雜程度低，SSH技術(shù)由于采用了接頭、差減雜交及兩輪抑制性PCR擴(kuò)增，可大量特異擴(kuò)增那些代表了差異表達(dá)的cDNA片段，因而減少了結(jié)果的復(fù)雜性。DNA固相化學(xué)合成全部反應(yīng)是在一個不大的固相柱子中進(jìn)行的，步驟如下：（1）將待活化的核苷酸上的539。（7）DNA的總濃度。在構(gòu)建表達(dá)載體時，為了防止由于克隆的外源基因的表達(dá)干擾了載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強(qiáng)的核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。（3） λDNA的非必需區(qū)組入選擇標(biāo)記基因，以方便對重組子進(jìn)行篩選。在進(jìn)行大量酶切回收實驗前，可采用小量酶切，經(jīng)過電泳檢測觀察酶切效率，以確定優(yōu)化的酶切條件。（2）識別序列都是回文序列。①菌落原位雜交：把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，使溶菌變性的DNA與濾膜原位結(jié)合，因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑是按照原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，這些帶有DNA印跡的濾膜烤干后，再與放射性同位素標(biāo)記的特異性DNA或RNA探針雜交。當(dāng)引物在16個核苷酸以下時，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。Ⅰ？Taq酶有什么不足之處？如何解決？DNA聚合酶Ⅰ有很大的局限性：① 該酶是熱敏感的，在雙鏈模板DNA解鏈溫度下會被破壞掉，每次循環(huán)之后都要添加新的聚合酶，不僅費(fèi)時乏味，且增加了實驗成本；② 該酶的反應(yīng)溫度偏低，容易造成引物與DNA模板的非專一性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。此時核酸分子在電場中的遷移速率受到分子形狀和大小的影響，在均一的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，它的遷移速率只與分子的大小相關(guān)，使不同分子量者分開，而相同分子量聚集形成條帶。②煮沸法：利用加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象，變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，通過高速離心（12,000（一）DNA水平的調(diào)控：（1） 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的調(diào)控作用，（2）基因修飾，（3） 基因重排，（4）基因擴(kuò)增。CAP與cAMP結(jié)合形成復(fù)合物才能刺激操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。（16）轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn），是一類較大的可移動成分，它是由幾個基因組成的特定的DNA片段，除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)并決定宿主性狀的基因（如抗藥性基因）。（5）啟動子（promoter）：是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始轉(zhuǎn)錄的序列，其大小不等，具有轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的mRNA的功能。（8）終止子（terminator），在基因3162。有兩種形式，一種形式是兩個反向排列的拷貝之間隔著一段間隔序列；另一種形式是兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔序列，這種結(jié)構(gòu)亦稱回文結(jié)構(gòu)（palindrome）?；蚪M龐大、復(fù)雜，具有許多復(fù)制起點，每個復(fù)制子大小不一。③防止化學(xué)因素(酸堿等)和物理因素(高溫或機(jī)械剪切等)引起核酸變性或破壞。含有細(xì)胞裂解液的體系在長時間超速離心平衡后，DNA的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡，染色體DNA、質(zhì)粒、RNA以及蛋白質(zhì)等，不同浮力密度的物質(zhì)可在管內(nèi)不同位置形成區(qū)帶。適用范圍：片段小于1000bp用聚丙烯酰胺凝膠，含高濃度（7mol/L)尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離短的（500b)的單鏈DNA或RNA，特別是實驗室手工小片段測序。②在設(shè)計時必須特別注意引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。：反向PCR，不對稱PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR反向PCR: 用于擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)的未知DNA序列。④固化探針雜交：原理是使未標(biāo)記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進(jìn)行測定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在1015min完成，檢測的敏感性為5106靶序列。胸腺嘧啶可以與腺嘌呤配對互補(bǔ)，所以采用oligo（dT）做引物，與mRNA3′端的poly（A）尾巴結(jié)合。（2） 帶有盡可能多的單一限制性酶切位點，以供外源DNA片段定點插入。②分泌型克隆表達(dá)載體pinⅢ系統(tǒng)：這個載體系統(tǒng)是以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的。雙元載體不僅構(gòu)建方便，而且其TDNA整合進(jìn)入植物細(xì)胞不需要帶進(jìn)許多冗余DNA序列，轉(zhuǎn)化效率高于一元載體。 （5）盒式PCR，盒式PCR可特異性地擴(kuò)增cDNA或基因組DNA上的未知區(qū)域。OH上的保護(hù)劑DMT，進(jìn)行下一輪延伸反應(yīng)。（4）SSH技術(shù)中所研究的材料的差異不宜太大，最好是只有細(xì)微差別。1轉(zhuǎn)化后對重組子進(jìn)行篩選的方法有哪些？重組子的篩選方法多種多樣，是由載體的類型、插入DNA片段大小和性質(zhì)，以及受體細(xì)胞的遺傳特性等的不同決定的。一步重疊延伸PCR法，其原理是首先將待突變的DNA 以相反的方向克隆到兩個載體中，這兩個載體除了多克隆位點相反外其余均相同，這樣便得到兩個模板。4. 外源基因在原核生物中表達(dá)時，蛋白質(zhì)的存在形式有哪些？各有什么優(yōu)缺點？① 包涵體表達(dá)：優(yōu)點：包涵體的形成有利于防止宿主蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解。優(yōu)點：解決了傳統(tǒng)發(fā)酵方法中因乙酸等代謝副產(chǎn)物的過高積累而限制工程菌的生長及外源基因的表達(dá)的問題。溶解包涵體的試劑包括變性劑（如尿素、鹽酸胍）和去垢劑（如Triton、SDS）等。⑥有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。（2）釀酒酵母生長迅速，工藝簡單，成本低。釀酒酵母和其他一些酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒，以這類質(zhì)粒為基礎(chǔ)可以建成高拷貝質(zhì)粒表達(dá)載體。4什么是轉(zhuǎn)基因動物？答案：轉(zhuǎn)基因動物是指由于外源DNA導(dǎo)入（包括同一物種的DNA）動物的基因組而產(chǎn)生了可以遺傳的改變的動物。下面介紹常用標(biāo)記基因的檢測方法。 ①氨芐青霉素抗性基因ampr: 四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 ②四環(huán)素抗性基因tetr：1994年，Hiei等通過使用農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)以及構(gòu)建VirG和VirB高效表達(dá)的超雙元載體，高效成功地轉(zhuǎn)化了水稻。2 HAT篩選方法的原理是什么？答案：在胸苷激酶基因(tk)表型缺陷型(tk)細(xì)胞培養(yǎng)中，如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(A)處理細(xì)胞，二氫葉酸還原酶被抑制，不能使二氫葉酸還原成四氫葉酸，其結(jié)果是培養(yǎng)基中的四氫葉酸因得不到補(bǔ)充而逐漸耗盡，于是從dUMP合成TTP以及dATP和dCTP的合成過程均被阻斷。因而更適合于治療用途；(7)畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細(xì)胞的毒害作用；(8)該表達(dá)系統(tǒng)由于對營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成份簡單廉價，可進(jìn)行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)AOX1基因缺失時，AOX2存在時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細(xì)胞利用甲醇能力降低。11. 重組質(zhì)粒發(fā)生逃逸的原因有哪些？① 重組質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時不均勻分配，造成受體菌種所含的重組質(zhì)粒拷貝數(shù)存在差異；② 來自受體細(xì)胞的遺傳影響；③ 重組質(zhì)粒所攜帶的外源基因過度表達(dá)，抑制了受體細(xì)胞的正常生長，以致原來體系中數(shù)目極少的不含重組質(zhì)粒的菌體經(jīng)過若干代繁殖后在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢；④ 重組質(zhì)粒因種種原因被受體細(xì)胞分泌運(yùn)輸至胞外，這種情況多發(fā)生在細(xì)菌處于高溫或含表面活性劑（如SDS）、某些藥物(如利福平）以及染料（如吖啶類）的環(huán)境中。⑤ 柱層析：根據(jù)蛋白質(zhì)的不同用途，需要對表達(dá)的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。缺點：有的基因工程菌在穩(wěn)定生長期會產(chǎn)生大量蛋白酶，降解外源基因表達(dá)產(chǎn)物。2. 原核表達(dá)系統(tǒng)中，常用的受體菌有哪些？各有什么特點？用于原核表達(dá)系統(tǒng)的常用宿主菌有：大腸桿菌，芽孢桿菌、鏈霉菌和藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）等。1對DNA進(jìn)行定點突變的方法有哪