【正文】 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。 如何使用酚 沉淀是濃縮核酸最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)如下： ①改變核酸的溶解緩沖液； ②重新調(diào)整核酸的濃度； ③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。 核酸的沉淀 表 1 核酸沉淀的鹽類及濃度 鹽 貯存液濃度（ mol/L) 終濃度 (mol/L) MgCl2 1 NaAc 3 () KAc 3 () NH4Ac 10 NaCl 5 LiCl 8 鹽的選擇 （ 1）乙醇 優(yōu)點(diǎn)：對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)：需要量大。 （ 2）異丙醇 優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的 DNA樣品沉淀。 缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與 DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去（最后用 70％乙醇漂洗數(shù)次）。 有機(jī)溶劑的選擇 （ 3）其他 沉淀的時(shí)間和溫度 一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與 DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用 0 ℃ 冰水（或室溫），1015 min， DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 DNA ： ① DNA樣品溶于 pH TE， 4 ℃ 或 20 ℃ 保存； ② 長(zhǎng)期保存樣品中可加入 1滴氯仿。 RNA ： ① RNA樣品溶于 mol/L NaAc ()或雙蒸滅菌水中， 70 ℃ 保存 。 ② 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中 。 ③ 在 RNA溶液中，加 1滴 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物 )凍貯于 70℃ ，可保存數(shù)年。 核酸的保存 核酸含量 /純度的測(cè)定 紫外分光光度法 原理： 根據(jù)核酸分子中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在 λ=260nm處有最大吸收值，可采用紫外分光光度法測(cè)定核酸的含量。1μg/ml的 DNA溶液的 A260 nm吸收值為 ， 1μg/ml的RNA溶液的 A260 nm吸收值為 ，以此為標(biāo)準(zhǔn)，可測(cè)得溶液中的核酸 含量 。 ? DNA 的 OD260/OD280值 大約為 。 ? 當(dāng) OD260/OD280大于 RNA污染。 ? 當(dāng) OD260/ OD280小于 。 ? 在波長(zhǎng) 260nm紫外光下， 1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為 50μg/ml；單鏈 DNA為 37 μg/ml； RNA為 40 ug/ml。 DNA的 純度 可用 OD260與 OD280的比值來衡量。 1. 測(cè) DNA： 純的 DNA樣品 OD260/OD280應(yīng)為 ， OD260m／OD230應(yīng)大于 。 1) OD260/OD280大于 ，表明有 RNA污染。 2) 小于 ，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于 ，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含 RNA的 DNA溶液比值為。 2. 測(cè) RNA 純的 RNA樣品其 OD260／ OD280約為 ，OD260/OD230比值應(yīng)大于 。 1）若 RNA樣品 OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于 ，可能被異硫氰酸胍等污染； 3） OD260/OD230比值小于 ，表明有小分子及鹽存在。 1. 帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與 其電荷性質(zhì)相反 的電極移動(dòng)，帶電分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度稱為電泳遷移率。 2. 電泳遷移率同 電場(chǎng)的強(qiáng)度 和分子本身所帶的 凈電荷數(shù)目 成正比。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)主要與 分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度 有關(guān)。 一、電泳的基本原理 4. 如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）且電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）， 分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的 大小和形狀 ，形狀相似的分子的遷移速度主要與 分子量 相關(guān) : 分子量越大，移動(dòng)越慢 。 5. 因此，電泳可以： ① 分離不同分子質(zhì)量的 DNA； ② 分離相同分子質(zhì)量但構(gòu)型不同的 DNA ,以及帶電荷多寡的 DNA； ③ 制備純化特定 DNA片段。 不同構(gòu)像的質(zhì)粒 Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的質(zhì)粒 DNA: 閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子 次之 ， 伸展開環(huán)狀 最慢 。 二 、瓊脂糖凝膠電泳 1. 瓊脂糖 2. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn) (或90 ℃ )后溶解，冷卻 (45 ℃ 后又凝固成均勻的的膠體。 是一種 線性多糖聚合物 ，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。 瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 濃度高 空隙小 瓊脂糖的濃度（ %） 分離 DNA的片斷大?。?bp） 1000—50000 1000—20220 300—6000 濃度大，空隙小，分辨率高： 小分子較易通過，而大分子難通過； 濃度小，空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。 3. 瓊脂糖凝膠的分辨力 濃度大小決定其分辨分子大小的能力。 ? DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有 電荷效應(yīng) 和 分子篩 效應(yīng)。 ? 核酸為兩性分子，在 pH ，整個(gè)分子帶正電 ,pH 8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。 ? 在堿性環(huán)境下，相同 堿基數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動(dòng) 。 具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的 DNA片段泳動(dòng)速度不一樣 ，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反 比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。 ? 可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA分子。 4. DNA在瓊脂糖凝膠的泳動(dòng)原理 凝膠染色 溴化乙錠 EB 主要有 溴化乙錠（ ethidium bromide, EB）染色法和 SYBR Gold染色法。 SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較昂貴。 EB是扁平分子，能 插入 DNA堿基之間 ， 但不與瓊脂糖結(jié)合。 EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)橙紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 熒光強(qiáng)度與 DNA含量及大小成正比 。 染色原理 用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA對(duì) DNA片斷大小的估算 ?EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì) ?EB可用來檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸 ?EB使用時(shí)的配制、貯存及使用 EB常用水配制成 10 mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為 μg/ml 。 ?EB可以直接加入凝膠中 ,也可以在電泳后將帶 DNA的凝膠放入 EB溶液中浸泡， 但當(dāng)要知道 DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無 EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色 。 凝膠的 EB染色的注意事項(xiàng) 凝膠介質(zhì) : 聚丙烯酰胺主要由 丙烯酰胺 和 N， N′ 甲叉雙丙烯酰胺 聚合而成 . 注意 : 丙烯酰胺為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為 ，為中樞神經(jīng)毒物。 N， N’ 甲叉雙丙烯酰胺也為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為 ，亦為中樞神經(jīng)毒物。 1%的稀溶液與皮膚接觸也會(huì)引起皮膚發(fā)炎，小鼠的確切致死量（ LD50）為 170mg/㎏ ，所以在實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)應(yīng)盡量避免與之直接接觸和吸入粉塵。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE） 三 、聚丙烯酰胺凝膠電泳 優(yōu)點(diǎn)：分辨率高。 聚丙烯酰胺凝膠濃度（ %） 分離 DNA片斷大?。?bp） 100—1000 25—500 1—50 瓊脂糖凝膠電泳： 100—50000 bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳： 1—1000 bp 四、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 (pulsedfield gel electrophoresis，PFGE ) 超過一定大小的雙鏈 DNA分子在瓊脂糖凝膠中幾乎以相同速率遷移 , 大于該極限長(zhǎng)度（ 50 kb）后 DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，即使用 %的瓊脂糖凝膠也不能對(duì)其分離 , 但工作需要常要進(jìn)行 分離大分子 DNA如分離大腸桿菌染色體 DNA。 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 PEGE 解決了這一問題。 為何選 PFGE？ B+ A +A B 脈沖電場(chǎng)電泳示意圖 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小， DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。反之，較小的 DNA 移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成功分離。 該法可分離分離大小在 10～ 2022 kb 之間的 DNA 片段。嚴(yán)格說來，應(yīng)叫 交替電場(chǎng)凝膠電泳 。 PFGE 工作的基本原理 五、凝膠電泳中的試劑 上樣緩沖液： 臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。 三個(gè)作用： 1）增加樣品密度保證 DNA沉入加樣孔內(nèi)； 2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過程； 3）指示劑（染料）在電場(chǎng)中的遷移可以為預(yù)測(cè)樣品的遷移位置作參考。 DNA上樣緩沖液配方 常用的電泳緩沖液 二者相比： 1） TAE的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化； 2） TBE比 TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量； 3） 雙鏈線狀 DNA片段在 TAE中比在 TBE中遷移快 10%； 4） 對(duì)于高分子質(zhì)量的 DNA， TAE的分辨率略高于 TBE，對(duì)于低分子質(zhì)量的 DNA， TAE要差些。超螺旋 DNA在 TAE中的電泳分辨率要好于 TBE。 復(fù)習(xí)幾個(gè)概念 ? 核苷： 戊糖 與 堿基 靠 糖苷鍵縮 合而成的化合物稱為核苷。 ? 核苷酸： 核苷分子中戊糖的 羥基 與 一分子磷酸 以 磷酯鍵 相連而成的化合物稱為核苷酸。 ? 核酸： 許多單核苷酸通過 磷酸二酯鍵 連接而成的高分子化合物，稱為核酸 。 ? 堿基對(duì)： 核酸分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶、鳥嘌呤與胞密啶總是通過 氫鍵相連 形成固定的堿基配對(duì)關(guān)系，因此稱為 堿基對(duì)， 也稱為堿基互補(bǔ)。 ? 核酸的變性： 在某些 理化因素 作用下，核酸分子中的 氫鍵斷裂 ，雙螺旋結(jié)構(gòu) 松散分開 ， 理化性質(zhì)改變 ， 失去原有的生物學(xué)活性 ，既稱為核酸變性。 ?Tm值 : 就是 DNA熔解溫度，指把 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度。 或者： DNA在加熱變性過程中，紫外吸收值達(dá)到最大值的 50%時(shí)的溫度 稱為核酸的變性溫度或解鏈溫度，用 Tm表示。 ?不同序列的 DNA， Tm值不同。 ?DNA中 G/C含量越高， Tm值越高，成正比關(guān)系。 ?Tm值與溶劑性質(zhì)有關(guān)。離子強(qiáng)度低， Tm值底。 有關(guān) Tm值 Tm值的計(jì)算： 1) 長(zhǎng)度為 25 mer以下的引物， Tm計(jì)算公式為： Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T) 2) 對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸， Tm計(jì)算公式為： Tm = + x Log10[Na+] + (%GC) – 600/size 公式中， Size = 引物長(zhǎng)度 核酸分子雜交技術(shù)： 具一定同源性的 兩條 (DNA或RNA)單鏈 在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按 堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則特異性地復(fù)性， 形成雙鏈 。 探針 (已知核酸片斷，單鏈 ) 待檢測(cè)核苷酸序列 (單鏈 ) 一、核酸分子雜交的概念 核酸分子雜交技術(shù)，是在 1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（ Carnegie Institute of Washington）的 Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的 原理 是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈 DNA或 RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其 相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu) 。 二、 核酸分子雜交 發(fā)明簡(jiǎn)史 三、核酸分子雜交的基本原理 ? DNA變性 ? 方法 ? 熱變性 ： 90~100℃ ? 酸堿變性 ：常采用堿變性 ? 化學(xué)試劑變