【正文】 第一章 生物技術(shù)：是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。 先進(jìn)的工程技術(shù)手段是指：基因工程、發(fā)酵工程、細(xì)胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程等新技術(shù)。 改造生物體：指獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物或微生物品系。 生物原料：指生物體的某一部分或生物生長過程產(chǎn)生的能利用的物質(zhì)，如淀粉、糖蜜、纖維素、生物堿、乙醇等有機(jī)物，也包括一些無機(jī)化學(xué)品，甚至某些礦石。 基因工程：指在基因水平上，采用與 工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，按照人類的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系。 DNA 重組技術(shù)：將目的基因與載體 DNA 在 體外 進(jìn)行重組，然后把這種重組 DNA 分子引入受體細(xì)胞，并使之增殖和表達(dá)的技術(shù)。也稱基因操作。 基因克?。?DNA 分子克?。涸隗w外重新組合 DNA 分子的實(shí)驗(yàn)過程中，是通過能夠獨(dú)立自主復(fù)制的載體分子質(zhì)粒或噬菌體為媒介的，將外源 DNA 或外源基因引入到寄主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從而獲得大量相同的重組 DNA 分子，或者外源基因表達(dá)獲得大量的蛋白質(zhì)。 基因工程理論依據(jù)：不同生物的基因 有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，遺傳密碼是通用的，基因是可切割的，基因是可以轉(zhuǎn)移重組的，基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。 基因工程的操作步驟：獲得目的基因，構(gòu)造重組 DNA 分子，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，表達(dá)，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化。 基因工程研究的發(fā)展可分為：①基因工程的準(zhǔn)備階段（在 40 年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；在 50 年代解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題；在 50 年代末期和 60 年代闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題）②基因工程問世（ 20 世紀(jì) 60 年代末 70 年代初，發(fā)現(xiàn)：限制性內(nèi)切酶和 DNA 連接酶等工具酶，使 DNA 分子進(jìn) 行體外切割和連接，即體外重組成為可能。）③基因工程的迅速發(fā)展階段（發(fā)展了一系列新的基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建各種克隆載體，培育出許多轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)了許多生物藥品。） 1973 年，基因工程誕生元年 1 轉(zhuǎn)基因動物 體內(nèi)帶有外源 DNA 的動物轉(zhuǎn)基因小鼠；“乳腺反應(yīng)器”工程 哺乳動物的乳腺作為反應(yīng)器；轉(zhuǎn)基因植物 改良植物性狀。 1 基因工程的發(fā)展：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表達(dá)（經(jīng)典基因工程）；第二代基因工程蛋白編碼基因的定向誘變（蛋白質(zhì)工程）；第三代基因工程代謝信息途徑的修飾重構(gòu)（途徑工程）； 第四代基因 工程基因組或染色體的轉(zhuǎn)移（基因組工程） 第二章（基因克隆載體 —— 質(zhì)粒） 克隆載體：是指運(yùn)載外源 DNA 有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源 DNA 在體外重組成 DNA 重組分子，在進(jìn)入受體細(xì)胞后形成一個復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。 載體的功能及特征：運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。 載體的三個基本結(jié)構(gòu)： 1） 至少有一個復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制；如果要正確表達(dá)還需啟動子和終止子； 2） 至少應(yīng)有一個多克隆位點(diǎn) ，以供外源 DNA 插入； 3） 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA 分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。 多拷貝 DNA 有兩個好處：一是可以用于大量制備克隆載體 DNA 分子，以利于外源基因的克隆，這樣可大大減少工作量；二是如果載體中插入了外源基因，那么外源基因的拷貝數(shù)也就大量增加了，這就有利于大量地表達(dá)外源基因，從而獲得大量的基因表達(dá)產(chǎn)物，這也正是基因工程的目的之一。 克隆位點(diǎn)：分子克隆載體的目的就是要將外源基因通過體外重組，形成重組 DNA 分子，然后再轉(zhuǎn)移到某種宿主細(xì)胞內(nèi)，那么克隆載體就應(yīng)該有一個位點(diǎn)供外源 DNA 插入 ，這個位點(diǎn)就是克隆位點(diǎn)。 克隆位點(diǎn)一定是一個限制酶切位點(diǎn)，而且必須是由 6 個核苷酸或 6 個核苷酸以上的序列 組成的限制酶識別位點(diǎn)。 為多克隆位點(diǎn)區(qū)：具有多個克隆位點(diǎn)的載體，而且將多個克隆位點(diǎn)集中在一個很短的序列內(nèi)，這種序列常常被稱之為多克隆位點(diǎn)區(qū)。 當(dāng)試圖把一個載體 DNA 或重組 DNA 分子導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞時，我們?nèi)绾沃垒d體或重組 DNA 分子已經(jīng)進(jìn)入了宿主細(xì)胞？答：標(biāo)記基因就能起到這個作用。獲得了外源 DNA 分子進(jìn)入的細(xì)胞被稱之為 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì) 胞：轉(zhuǎn)化細(xì)胞有了新的表型，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞仍保持原有的表型。 標(biāo)記基因的 功能 ：①指示哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞， 選擇標(biāo)記基因； ②標(biāo)記基因還有一個十分重要的功能，即指示外源 DNA 分子是否插入載體分子形成了重組子， 篩選標(biāo)記基因。 標(biāo)記基因的種類：（ 1）抗性標(biāo)記基因（可分為抗生素抗性基因、重金屬抗性基因、代謝抗性基因），（ 2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因），（ 3) 生化標(biāo)記基因（基因的表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)）。 1 原核生物的標(biāo)記基因要用于其它生物時，應(yīng)對這些基因進(jìn)行改造，將 基因的啟動子和終止子換成另一種生物的基因啟動子和終止子。 1 載體分類：按照載體的 復(fù)制子來源劃分 ：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、混合型載體、人工染色體載體。按照克隆載體的 功能或用途來劃分 ：普通型載體或克隆載體、表達(dá)型載體、其它特殊用途類型。 1 質(zhì)粒型載體：所含的復(fù)制起點(diǎn)主要來自不同的原核生物，特別是大腸桿菌和一些低等真核生物中的質(zhì)粒 DNA，有的復(fù)制起點(diǎn)則來自染色體 DNA（如酵母菌）。許多載體 DNA 上只含有一種復(fù)制起點(diǎn)；然而有的克隆載體卻含有兩種復(fù)制子序列，這類載體能在這兩種不同的生物中自主復(fù)制。 1 病毒型載體：所含的復(fù) 制起點(diǎn)是來自病毒 DNA。使用得最廣泛的動物病毒復(fù)制起點(diǎn)來源子 SV40。 1 混合型載體：這類載體復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)粒和病毒。粘粒載體、噬菌粒載體等，這類混合型載體也是穿梭型的，即它們既可以在大腸桿菌中復(fù)制，亦可在動物細(xì)胞中復(fù)制。 1 人工染色體載體：指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。 1 普通型載體：這類載體主要用于各種基因組文庫和 cDNA 文庫的建立。 1 表達(dá)型基因：這類載體主要用于研究基因的表達(dá)或是用于大量生產(chǎn)一些有用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)，有的也可用于 cDNA 文庫的建立。 1 其它特殊用途類型：定位整合載體、 啟動子探針型克隆載體、誘導(dǎo)表達(dá)型載體、組織特異型表達(dá)載體。 質(zhì)粒：是一類特別亞細(xì)胞有機(jī)體。它的結(jié)構(gòu)比病毒還要簡單些，只能夠在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立地增殖，并隨著宿主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。一個質(zhì)粒就是一個 DNA 分子，一般以超螺旋共價閉環(huán) DNA 的形式存在。 2 質(zhì)粒的分布：廣泛存在于多種細(xì)菌的細(xì)胞中，在某些藍(lán)藻、真菌和綠藻的細(xì)胞中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒分子的存在。 2 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性：（ 1）分子?。?1～ 200 kb，多數(shù) 10kb；（ 2）編碼基因少： 2～ 3個中等大小的蛋白質(zhì) ；（ 3）環(huán)形狀：絕大多數(shù)是雙鏈環(huán)狀 DNA；（ 4）質(zhì)粒 的空間構(gòu)型：① 共價閉合環(huán)狀 DNA，呈超螺旋（ SCDNA）；② 開環(huán) DNA（ OCDNA）；③ 線形 DNA（ IDNA）；（ 5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率： scDNA 最快、 l DNA 次之、 ocDNA 最慢。 2 根據(jù)宿主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)分類：一種是低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個宿主細(xì)胞中僅含有 1—3 份的拷貝，我們稱這類質(zhì)粒為“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒；另一類是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個宿主細(xì)胞中可高達(dá) 10 一 60 份拷貝，這類質(zhì)粒被稱為“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒。 2 質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA 復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制；質(zhì)粒 DNA 上的 復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。 2 質(zhì)粒不相容性：指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 2 在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥 (稀釋 )掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。 2 質(zhì)粒的遷移作用：由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。 2 接合型質(zhì)粒：分子比較大，編碼有一套控制質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)移的 tra 基因。其占據(jù)質(zhì)粒的三分之一 (～ 33 kb)，稱為轉(zhuǎn)移區(qū)，包括編碼 F 性菌毛、穩(wěn)定接合配對、轉(zhuǎn)移的起始和調(diào)節(jié)等，總共約 40 個基 因。 2 非結(jié)合質(zhì)粒：不含 tra 基因的質(zhì)粒；分子小、拷貝數(shù)多、不會自行結(jié)合轉(zhuǎn)移、比較安全。 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略：在宿主細(xì)胞進(jìn)行有效的復(fù)制，且有較多的拷貝數(shù)；松弛型復(fù)制起始點(diǎn)；克隆位點(diǎn)（或多克隆位點(diǎn)）；標(biāo)記基因（外源基因插入失活）；載體分子盡可能?。ǜ咿D(zhuǎn)化率、更大片段）；表達(dá)載體（啟動子、終止子等）；生物安全。 3 質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程應(yīng)遵循幾條原則：選用合適的出發(fā)質(zhì)粒；正確獲得構(gòu)建載體的元件；組裝合適的選擇標(biāo)記基因；選用合適的啟動子；力求構(gòu)建過程簡單。 3 構(gòu)建載體的手段：酶切＋修飾＋連接 3 pBR322 載體長 4362 bp，它有一個來自 ColE1/ pMB1 的復(fù)制起點(diǎn) (ori)，這個復(fù)制起點(diǎn)可使 pBR322 在大腸桿菌中的拷貝數(shù)達(dá)到 20 個。（ P 表示一種質(zhì)粒） 3 如何判定宿主細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)化？ ：將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在一種加有氨芐青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基上，然后放在 37℃下培養(yǎng)。只有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能生長，因?yàn)?pBR322 有 Apr 基因和 Tcr 基因。 3 如何判定轉(zhuǎn)化的載體是否為重組的？氨芐青霉素抗性基因中有 ScaI 和 PstI 兩個克隆位點(diǎn)的，插入滅活，這種重組子就再也不會賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞以氨芐青霉素抗性，因此，這種重組子所轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞就只能涂布在加有四環(huán)素的平板上。 四環(huán)素抗性基因中有 BamHI 和 SalI 兩個克隆位點(diǎn)，插入滅活。 3 pBR322 的缺點(diǎn)：保留了轉(zhuǎn)移蛋白（ mob）的 bom 作用位點(diǎn)，能夠被 ColK 質(zhì)粒編碼的mob 蛋白識別，如果再有 F 質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移。雙抗生素標(biāo)記（負(fù)篩選法） 3 pUC 系列載體有三點(diǎn)與 pBR 系列載體不同：一是 pUC 載體較小，全長僅 2686 bp； copy 2020～ 3000/cell；二是只保留了一個藥物抗性基因 Apr，另一個標(biāo)記基因是β 半乳糖苷酶基因，該基因是一個生化標(biāo)記基因，極易檢測，（正篩選法）；三 是有一個多克隆位點(diǎn)區(qū)，共有10 個克隆位點(diǎn)，極有利于克隆外源基因。 3 在 pUC18 載體中，有兩個標(biāo)記基因：一是 Apr 基因，它專門用于指示 DNA 分子是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞；另一個是 LacZ 基因，它能產(chǎn)生β 半乳糖苷酶α 鏈，作為重組子篩選標(biāo)記（藍(lán)白篩選）。 3 藍(lán)白斑形成 ： pUC 質(zhì)粒載體上的 lacZ 編碼α肽與大腸桿菌的 LacZ△ M15 編碼的缺失突半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成 4 聚體，又能分解 Xgal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落。 pUC 載體上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位點(diǎn) (MCS)區(qū)，本身雖不干擾 LacZ’ 的合成，但 插入外源基因 就會阻止 LacZ’的合成。不能互補(bǔ)，因此形成 白色菌落 。 MCS 無外源基因插入時，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑； MCS 上插入外源 DNA 后，不互補(bǔ)，白菌斑。 4 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒載體 4 野生型根癌農(nóng)桿菌的 Ti 質(zhì)?？筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類型分為：章魚堿類，胭脂堿類、農(nóng)桿堿型和琥珀堿類等。 4 Ti質(zhì)粒攜帶著既能合成又能分解這些化合物的酶類的相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá)，它們只有進(jìn)入植物細(xì)胞后才能表達(dá)， Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細(xì)胞提供能源、氮源和碳源。 4 Ti質(zhì)粒的結(jié) 構(gòu)： Ti質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀 DNA 分子，其長度為 160250 kb； 4 Ti有 5 個功能區(qū)：（ 1) TDNA 區(qū)： 12 24 kb （ 2)冠癭堿分解區(qū)；（ 3)毒性區(qū)（ Vir）； （ 4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū) (tra/con)；（ 5)DNA 復(fù)制區(qū)（ Rep）。 4 Ti 質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制：損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導(dǎo) Ti質(zhì)粒上的 vir 基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達(dá)。 vir 基因產(chǎn)物將 Ti質(zhì)粒上的 TDNA 單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈 TDNA 結(jié)合形成復(fù)合物， 后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。 4 T－ DNA 上有三套基因，其中兩套基因 tms、 tmr 分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因 Onc 基因合成冠癭堿。 3個同源區(qū)段，含有 6 個基因位點(diǎn)，是冠癭瘤形成所必需的，統(tǒng)稱“致癌基因”。 4在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個 25 bp 直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA 區(qū)域叫做 TDNA (transfer DNA) ，插入植物染色體中的 Ti 質(zhì)粒片段只有 TDNA。由于TDNA 插入植物細(xì)胞染色體中的位置不相同的，因此植物染 色體上可能并沒有可供 TDNA 插入的專一性 DNA