【正文】 1 雙鏈 cDNA 的克?。弘p鏈平頭的 cDNA 通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收。它與基因文庫最低所含克隆數(shù) N 之間的關(guān)系可用下式 表示 N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )， P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?， f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 1 基因文庫的質(zhì)量標準：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克??；克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。 構(gòu)建基因組文庫：根據(jù)載體不同分：λ噬菌體基因組文庫， Cosmid 基因組文庫， YAC 基因組文庫 cDNA 文庫的構(gòu)建：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種 cDNA片段與克隆載體重組，存儲在一種宿主菌群體中，這樣的群體稱為 cDNA 文庫。 構(gòu)建基因組文庫分離法：提取基因組 DNA，擴增所有基因，克隆篩選。 目的基因的制備：直接分離法，構(gòu)建基因組文庫法，構(gòu)建 cDNA 文庫法， PCR 擴增法，基因的化學合成。該結(jié)構(gòu)與結(jié)合于核糖體 30S小亞基上的 16SrRNA 的 3’端序列“? UCCUCCA?”互補， 成為 16SrRNA 識別、結(jié)合 mRNA的位置，核糖體由此位置向前移動，尋找 mRNA 的起始密碼子 AUG。 基因的組成：有表達功能的基因：轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，核糖體識別區(qū)，編碼區(qū)（起始密碼、開讀框、終止密碼），轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。 2 陽性重組子的終極鑒定：（ 1）核酸序列測定：化學降解測序法，雙脫氧鏈終止法；（ 2）蛋白質(zhì)序列分析。 2 免疫印跡（ western blotting）法：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。二 抗：與一抗的特異性結(jié)合。 2 菌落原位 western blotting 程序：①將菌落或嗜菌斑影印到 NC 等固相支持物上；②用氯仿飽和氣體裂解菌落；③進行第一抗體反應(yīng)；特異抗體④進行第二抗體反應(yīng)；種特異性抗體或 A 蛋白；⑤放射自顯影或酶標顯色反應(yīng)。 2 免疫學方法檢測克隆子：對于表達載體，陽性克隆子，可表達出外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，我們可以用相應(yīng)的抗體，來檢測陽性克隆。在 70%甲酰胺中，把 DNA 雙鏈變性，復(fù)性的時候， DNARNA 雜 交分子比 DNADNA 雙鏈更穩(wěn)定。從宿主細胞中提取 RNA，再用探針雜交。 Northern blotting：用 DNA（或 RNA）探針檢測 RNA 樣品。從宿主細胞中提取 DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。 1 核酸分子雜交： Southern 印 跡雜交， Northern 印跡雜交，斑點印跡雜交或狹縫印跡雜交。 PCR 法程序：①挑取待鑒定的菌落；②加入重組 PCR 鑒定試劑；③瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 1 利用 PCR 方法篩選確定重組子： PCR 能在模板序列上擴增出目的 DNA 片斷。 1 形成嗜菌斑篩選法：噬菌體載體，外源 DNA 與噬菌體載體重組后，只有重組 DNA 分子的大小在野生型λ噬菌體 DNA 長度的 78％～ 105％范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基平板上形成噬菌斑，而非轉(zhuǎn)化子為正常菌落。 1 營養(yǎng)缺陷型檢測法：①彌補缺陷：轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。對于 dhfr－突變受體細胞，由于它不能合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，因此不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長；不過，如果在常規(guī)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸苷，則突變體細胞可以借助核苷酸的補救合成途徑維持生長 。 1 二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）：二氫葉酸可通過 dhfr 轉(zhuǎn)化為四氫葉酸。 氨基喋啉（ A） 的抑制作用：氨甲喋啉是葉酸的類似物。一般是 HAT 選擇法。 利用遺傳標記篩選轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、胸腺核苷激酶基因 （ tk）、二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）、黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。常用的報告基因有：抗生素抗性基因，編碼某些酶的基因，編碼特殊產(chǎn)物的基因。 利用 lacZ 基因設(shè)計的藍白斑篩選法 ： 1 lacZ 基因：編碼β 半乳糖苷酶； 2 宿主菌是突變株 ,其 lacZ△ M15 基因：表達β 半乳糖苷酶的 C 端肽段； 3 質(zhì)粒 lacZ’基因：β 半乳糖苷酶N 端肽段（α肽）； 4 在 IPTG 誘導(dǎo)下， lacz’ 基因被誘導(dǎo)表達產(chǎn)生的β 半乳糖苷酶 N 端肽， 與受體菌表達的β 半乳糖苷酶的 C 端肽互補而具有β 半乳糖苷酶活性（稱為α 互補）； 5 半乳糖苷酶水解 Xgal 而使菌落呈現(xiàn)藍色； 6 當外來序列插入后則破壞了 lacz ’編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色。 pBR322 質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因 : Tetr 和 Ampr； Tetr 上有插入位點 BamH I 和 Sal I。鏈霉 素：含 Str 抗性基因的菌體轉(zhuǎn)譯一種能修飾 Sm 的酶，抑制 Sm 與核糖體的結(jié)合。氯霉素：含 cat 基因的菌體能轉(zhuǎn)譯氯霉素乙酰轉(zhuǎn)?；?，使 Cm 乙酰化而失效。篩選方法：抗藥性篩選，營養(yǎng)缺陷互補篩選，顯色互補篩選。 篩選陽性克隆：（ 1）針對克隆子遺傳表型改變的初步篩選法：抗生素平板篩選、利用 lacZ基因設(shè)計的藍白斑篩選；（ 2）分析重組子結(jié)構(gòu)特征的進一步篩選法：內(nèi)切酶圖譜分析、 PCR 核酸雜交；（ 3）分析克隆子表達產(chǎn)物的篩選方法：免疫化學檢測法、轉(zhuǎn)譯 篩選法、基因表達產(chǎn)物分析法；（ 4）陽性克隆子的終極鑒定：核酸序列測定、蛋白質(zhì)序列分析。 第二章 ：克隆子的篩選與鑒定 重組子：目的基因與克隆載體結(jié)合。 2 DNA 的直接轉(zhuǎn)移法：物理方法：電穿孔法，基因槍法，激光微束穿孔法 ，顯微注射法；化學方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法；生物方法：花粉管通道法。 2 重組 DNA 分子導(dǎo)入植物細胞：⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法；（羥基乙酰丁香酸）⑵ DNA 直接轉(zhuǎn)移法。定義：每微克載體 DNA 在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)；或者每微克載體 DNA 轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納 DNA 的個數(shù)，即克隆數(shù)。 1 重組噬菌體 DNA 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌遺傳性狀改造：限制與修飾系統(tǒng)（ hsd R）；重組系統(tǒng)（ rec）；易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo) LamB 膜蛋白；有明顯的選擇性差異，選擇性互補的遺傳標記； 感染寄生缺陷型。 1 體外包裝是指在體外模擬噬菌體 DNA 分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體 DNA 分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。 1 重組噬菌體 DNA 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌：將重組噬菌體導(dǎo)入受體細胞過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 1 細胞的處理：收集對數(shù)生長中期的大腸桿菌，離心，用低鹽的緩沖液充分洗離心， 然后用 10％甘油重懸細胞，使其細胞濃度為 3 1010 個 /ml，分裝，在干冰速凍，－ 70℃儲存。電壓增高或電脈沖時間延長，轉(zhuǎn)化效率會提高，但同時導(dǎo)致受體細胞存活率的下降，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。 1 電穿孔轉(zhuǎn)化法：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源 DNA 的有效吸收。 1 CaCl2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機理：在 0℃的 CaCl2 低滲溶液中，細菌發(fā)生膨脹，同時 Ca2+使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜浴內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)； Ca2+能與加入的 DNA 結(jié)合，形成 DNase 的羥基－磷酸鈣符合物，并黏附在細菌外表面上；當 42℃熱刺激短暫處理細菌，細胞膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為 DNA 提供了進入細胞的通道。 1 重組 DNA 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：用 NTE 緩沖液溶解的 重組 DNA（約含 40ng），加入到 感受態(tài)細胞中，冰浴 1 小時，期間輕搖幾次。大腸桿菌不容易進行自然轉(zhuǎn)化，需人工制備感受態(tài)細胞。缺點：培養(yǎng)技術(shù)要求高；營養(yǎng)條件高，培養(yǎng)周期長?？捎美w維素酶等處理獲得原生質(zhì)體，導(dǎo)入外源基因；也可通過農(nóng)桿菌或基因槍導(dǎo)入外源基因。常用的是酵母菌：基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳分析相對容易；具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)；不產(chǎn)生毒素，安全；培養(yǎng)簡單，利用大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；能將目的基因產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。（ 3）藍藻：是一類光能自養(yǎng)型生物，通過葉綠素a 進行光合作用，營養(yǎng)要求低，容易大規(guī)模生產(chǎn)；可作為植物基因表達的宿主。 常用的原核細胞：（ 1）大腸桿菌：目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達系統(tǒng)，對其特性和遺傳背景了解得最清楚，目的基因表達水平高，培養(yǎng)周期短。 原核生物細胞：優(yōu)點：沒有纖維素組成的細胞壁，便于外源 DNA 的進入；沒有核膜， DNA沒有固 定結(jié)合蛋白，外源 DNA 易于與宿主 DNA 分子重組；基因組簡單，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；多為單細胞，易培養(yǎng)，分裂增殖快，實驗周期短。 受體細 胞的條件：便于重組 DNA 分子的導(dǎo)入（轉(zhuǎn)化親和性）；能使重組 DNA 分子穩(wěn)定存在于細胞中；便于重組體的篩選；遺傳穩(wěn)定性高、易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；安全性高、無致病性、不會對外界環(huán)境造成生物污染；有利于目的蛋白質(zhì)的表達和分泌；遺傳密碼的應(yīng)用無明顯偏倚性；具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制；便于真核目的基因的高效表達；在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。 7 重組 DNA 技術(shù)中常用的工具酶與其功能：⑴限制性核酸內(nèi)切酶：識別特異序列，切割DNA；⑵ DNA 連接酶：催化 DNA 中相鄰的 5’磷酸基和 3’羥基末端之間 形成二硫鍵，使DNA 切口封合或使兩個 DNA 分子或片段鏈接；⑶ DNA 聚合酶Ⅰ：①合成雙鏈 cDNA 的第二條鏈②缺口平移制作高比活探針③ DNA 序列分析④填補 3’末端；⑷反轉(zhuǎn)錄酶：①合成 cDNA②代替 DNA 聚合酶Ⅰ進行填補，標記或 DNA 序列分析；⑸多聚核苷酸激酶：催化多聚核苷酸 5’羥基末端磷酸化，或標記探針；⑹末端轉(zhuǎn)移酶：在 3’羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾；⑺堿性磷酸酶：切除末端磷酸基。 7 單鏈 DNA 內(nèi)切酶：一、 S1 核酸酶：來源：稻谷曲霉；特性：（ 1）高度單鏈特異性，（ 2）反應(yīng)條件：① 低水平 Zn2+ ② ~；功能：（ 1）催化單鏈 RNA 或 DNA 降解，（ 2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)，（ 3）降解限制酶切形成的單鏈 突出端，（ 4）不能降解雙鏈 DNA 或RNADNA 雜交鏈；用途：（ 1）定位 RNA，（ 2）用 mRNA 測定基因中的外顯子序列。 70、 單鏈 DNA 外切酶：大腸桿菌核酸外切酶 I（ exo I）切割方式 5’→ 3’識別位點 5’ OH 大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（ exo Ⅶ）切割方式 5’→ 3’、 3’→ 5’識別位點 5’ P、 3’ OH。一、單鏈 DNA 外切酶： 1. 大腸桿菌核酸外切酶 I（ exo I） 5’→ 3’外切，識別 5’ OH； 2. 大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（ exo Ⅶ） 5’→ 3’、 3’→ 5’外切，識別 3’ OH、 5’ P。 6 堿性磷酸酶：種類：（ 1）細菌性堿性磷酸酶，（ 2）小牛腸堿性磷酸酶；特性：催化脫掉DNA（或 RNA） 5’端的磷酸根；功能：防止線性化的載體份子自我連接。（ 2）修飾后的 T7 DNA 聚合酶的用途：① DNA 測序② 標記 DNA 3’隱蔽末端③ 更有效地補平末端 6 逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴 RNA 的 DNA 聚合酶（ RNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶）。 6 T7 DNA 聚合酶的特點：① 持續(xù)合成能力強；② 3’→ 5’外切酶活性高；③ 不受 DNA二級結(jié)構(gòu)的影響 6 T7 DNA 聚合酶的用途：① 以大分子量 DNA 為模板的合成，② 進行末端標記，③ 補平隱蔽末端。 iii）偶聯(lián)酶及其底物：常用的兩種酶：辣根過氧化物酶 （ HRPO）、堿性磷酸酶（ AP）酶的作用：催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。 ii）地高辛標記：可以與 dNTP 連接成地高辛 dUTP 等，參入 DNA 合成過程。缺點：半衰期短（ 32P 只有 天）、 不易保存、 對人體有害、要求在專門實驗室操作。 5 T4 DNA 聚合酶的用途：① 補平隱蔽末端；② DNA 3’末端標記（標 記末端（取代合成法）用 3’→ 5’外切酶活性作用于所有末端形式的 3’端（平端、 3’隱蔽端、 5’隱蔽端）制造出 3’隱蔽端；再利用它的 5’→ 3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的 dNTP。② 酶活性：有 5’→ 3’聚合酶活性和 3’→ 5’外切酶活性（降解單鏈更快）。③ cDNA 第二鏈的合成。 5 Klenow fragment 的主要用途：① 3’端補平：補平限制性內(nèi)切酶切后形成的 3’隱蔽端。 5 Klenow fragment 的性質(zhì)：具有 5’→ 3’聚合酶活性和 3’→ 5’外切酶活性。 5 DNA 聚合酶 I（ Pol I）的反應(yīng)條件：① 底物 dNTPs；② Mg2+；③ 帶有 3’ — OH 游離端的引物；④ DNA 模板 5 DNA 聚合酶 I 對探針序列的標記： a 放射性同位素標記：切口轉(zhuǎn)移