【正文】 。（2）酵母雙雜交系統(tǒng)利用融合蛋白的策略，將要篩選的“探針”蛋白X與BD融合為BDX（通常稱為誘餌， bait）（3）將所要篩選的對(duì)象Y與AD構(gòu)建成融合蛋白的ADYcDNA文庫(kù)（即將目的cDNA與AD基因構(gòu)建融合基因文庫(kù)），通常稱ADY為獵物（prey）（4）將它們導(dǎo)入酵母細(xì)胞中共表達(dá)，如果X與Y相互作用，則會(huì)導(dǎo)致BD和AD在空間上接近形成一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。③ 信號(hào)肽序列3. 酵母雙雜交的基本原理？（1）來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptionalactivator）GAL4是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，有兩個(gè)功能域: 一是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain, BD）靠近羧基端,含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可與DNA序列中半乳糖苷酶的上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）結(jié)合；二是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain, AD，可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFII相互作用，提高RNA聚合酶的活性。優(yōu)點(diǎn)① 是真核生物，大多具有較高的安全性② 繁殖速度快，能大規(guī)模生產(chǎn)，具有降低基因工程產(chǎn)品成本的潛力③ 將原核生物中已知的分子和基因操作技術(shù)與真核生物中復(fù)雜的轉(zhuǎn)譯后修飾能力相結(jié)合，能方便地用于外源基因的操作④ 采用高表達(dá)啟動(dòng)子，可高效表達(dá)目的基因，而且可誘導(dǎo)調(diào)控⑤ 提供了翻譯后加工和分泌的環(huán)境，使得產(chǎn)物與天然蛋白一樣或類似⑥ 酵母菌可將表達(dá)的外源蛋白與末端前導(dǎo)肽融合，指導(dǎo)新生肽分泌，同時(shí)在分泌過(guò)程中可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾⑦ 不會(huì)形成不溶性的包涵體，易于分離提純⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作為藥物使用中引起免疫反應(yīng)的問(wèn)題⑨ 酵母菌（主要是釀酒酵母）已完成全基因組測(cè)序，它具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力⑩ 酵母可進(jìn)行蛋白的N乙?；?、C甲基化，對(duì)定向到膜的胞內(nèi)表達(dá)蛋白具有重要作用。？尋找人生長(zhǎng)因子含量豐富的細(xì)胞，從中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR獲取目的基因。定向打靶載體：將正向選擇標(biāo)記（如neor）基因置于發(fā)生同源交換的序列中間，同源臂外側(cè)為真核細(xì)胞的負(fù)選擇標(biāo)記（如TK基因）以及在原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和篩選的載體。⑸ 轉(zhuǎn)基因個(gè)體鑒定接受胚胎移植的假孕鼠產(chǎn)下的幼鼠是否含有外源基因？（1）分子鑒定，判定其基因組內(nèi)是否整合了外源基因（2）目的蛋白表達(dá)與否和表達(dá)水平測(cè)定（3）產(chǎn)物的分離純化及生物活性檢測(cè)胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠5. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定方法有哪些？（1）標(biāo)記篩選法利用正負(fù)篩選標(biāo)記（2）分子鑒定法：PCR擴(kuò)增、斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、熒光原位雜交（3）表達(dá)水平檢測(cè)：報(bào)告基因檢測(cè)、Northern雜交、RTPCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western雜交、目的蛋白的生物活性檢測(cè) 報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、常用于判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織），是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途的基因。 d假孕鼠子宮內(nèi)。⑶ 顯微注射（1）外源DNA進(jìn)入原核（2）培養(yǎng)液中培養(yǎng)（3）進(jìn)行冷凍保存，或直接用于移植，或繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育到囊胚后再移植。⑵ 基因準(zhǔn)備從整合率上看線形DNA分子要好于環(huán)形DNA，而環(huán)形DNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，適用于瞬間表達(dá)與基因治療。4. 簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)基因小鼠的制備過(guò)程。核移植法是將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過(guò)程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。顯微注射法（microinjection）是利用玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組（rearrangement）、缺失（deletion）、復(fù)制（duplication）或易位（translocation）等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。蛋白和反轉(zhuǎn)錄酶。第十四章1. 簡(jiǎn)述反轉(zhuǎn)錄病毒在動(dòng)物基因工程中的作用。6. 植物轉(zhuǎn)化常用的選擇基因和報(bào)告基因有哪些？報(bào)告基因有什么特點(diǎn)？選擇基因：新霉素抗性基因（neor）、慶大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（hpt），以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）報(bào)告基因：β葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白（GFP）基因（gfp）特點(diǎn)：① 報(bào)告分子不存在于宿主中或易于與內(nèi)源性基因相區(qū)別② 應(yīng)有一個(gè)簡(jiǎn)單、快捷、靈敏及經(jīng)濟(jì)的分析方法③ 報(bào)告基因的分析結(jié)果應(yīng)具有很強(qiáng)的線性范圍，便于分析啟動(dòng)子活性的大小變化④ 報(bào)告基因的表達(dá)必須不改變受體細(xì)胞或生物體生理活動(dòng)7. 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些？鑒定：1. PCR檢測(cè)外源基因的整合2. Southern 雜交檢測(cè)外源基因的整合3. RTPCR 檢測(cè)外源基因的表達(dá)4. Northern雜交檢測(cè)外源基因的表達(dá)5. Western雜交檢測(cè)外源基因表達(dá)的產(chǎn)物8. 簡(jiǎn)述建立植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的主要考慮因素影響基因受體選擇的因素包括基因轉(zhuǎn)化方法、受體的再生能力、受體材料的生理狀態(tài)和再生途徑，以及體細(xì)胞無(wú)性系變異的發(fā)生等。5. 什么是二元載體？和一元載體比有什么優(yōu)點(diǎn)？雙元載體(binary vector)系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含TDNA和Vir區(qū)的相容性突變質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，也因?yàn)槠銽DNA與Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過(guò)反式激活TDNA轉(zhuǎn)移故稱之為反式載體(trans vector)優(yōu)點(diǎn)：首先，二元載體的構(gòu)建較為方便；而一元載體還需在根癌農(nóng)桿菌中進(jìn)行共整合，構(gòu)建效率相對(duì)較低。Vir產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生一條新的TDNA單鏈分子。Vir區(qū)位于TDNA以外的一個(gè)35 kb 內(nèi)，其產(chǎn)物對(duì)TDNA的轉(zhuǎn)移及整合必不可少。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物的時(shí)候，菌體本身并不進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，而僅是Ti質(zhì)粒中的一部分稱之為“TDNA”的DNA片段進(jìn)入寄主細(xì)胞并插入基因組中，TDNA中的基因利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。利用接頭錨定的方法提高了全長(zhǎng)DNA的比例。4. 如何構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)有三種方法：SMART法，captrapper法，TAP（煙草酸焦磷酸酶）法SMART法：利用反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在第一鏈cDNA3’末端加上幾個(gè)dC。3. 扣除cDNA的基本原理是什么？將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測(cè)樣本（tester），將基因表達(dá)譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為對(duì)照樣本（driver）。2. 均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建的基本原理是什么？?jī)煞N方法：基因組DNA飽和雜交法和基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法基因組DNA飽和雜交法:原理是不同表達(dá)水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相同基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法：高豐度cDNA復(fù)性所需時(shí)間短，低豐度cDNA復(fù)性所需時(shí)間長(zhǎng)。主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測(cè)序等，在基因組研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。利用它們?cè)诤Y選上的優(yōu)勢(shì)來(lái)分離單個(gè)