基因重組和基因工程培訓(xùn)課程-資料下載頁
2025-01-07 18:00本頁面
【正文】 co RⅠ Eco RⅠ 目錄 ?受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) ?導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導(dǎo)入受體菌（轉(zhuǎn)） 目錄 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等 （五）重組體的篩選（篩） 目錄 (插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇 目錄 α互補(bǔ) 利用 α互補(bǔ)原理篩選重組體 pUC18 目錄 原位雜交 目錄 Southern印跡 目錄 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出 免疫學(xué)方法 目錄 重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 篩 篩選重組體 目錄 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 目錄 表達(dá)體系的建立： ? 表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 受體細(xì)胞的建立 ? 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達(dá) 目錄 ? 標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) ? ： 不宜表達(dá)真核基因組 DNA； 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)； 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ； 很難表達(dá)大量可溶性蛋白。 1. 原核表達(dá)體系 ( ) 目錄 大鼠胰島素原 cDNA 的表達(dá)和分泌 目錄 目錄 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 ? 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時、經(jīng)濟(jì) ? 轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞） 目錄 表達(dá)載體 pFASTBACI 的物理圖譜 目錄 表達(dá)載體 YEpI PT的物理圖譜 目錄 第三節(jié) 重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué) 的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大 DNA Rebination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 目錄 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機(jī)制。 ? 疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個典型例子 : 脆性 X綜合征 Kallmann綜合征 目錄 二、生物制藥 ?利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為 21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。 ?美國 Eli Lilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。 目錄 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)凝血 顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成 生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長與分化 生長素 治療侏儒癥 胰島素 治療糖尿病 干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤 白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞 超氧化物歧化酶 抗組織損傷 單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療 乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝 口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂 目錄 基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 ， 在DNA水平分析 、 鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換 、 缺失或插入等突變 。 又稱DNA診斷 。 三、基因診斷與治療 （一）基因診斷的概念 目錄 ?基本過程： 區(qū)分或鑒定 DNA的異常 分離、擴(kuò)增待測的 DNA片斷 目錄 ? 能正確擴(kuò)增靶基因； ? 能準(zhǔn)確區(qū)分單個堿基的差別； ? 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。 ? 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。 ?標(biāo)準(zhǔn)： 目錄 （二）基因治療的概念 ?定義 基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。 ?方式 體細(xì)胞基因治療 (somatic cell gene therapy) 性細(xì)胞基因治療 (germ line gene therapy) 目錄 1. 產(chǎn)前診斷 2. 攜帶者測試 3. 癥候前診斷 4. 遺傳病易感性 四、遺傳疾病的預(yù)防 目錄 掌握內(nèi)容： ? 重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念： DNA克隆，基因重組與基因工程中常用的工具酶，限制性內(nèi)切酶的概念分類及切割方式，目的基因及獲取，載體特點(diǎn)和種類（質(zhì)粒，嗜菌體載體 。 Cosmid vector， YAC。 病毒載體，穿梭載體）克隆與表達(dá)載體的特點(diǎn)和應(yīng)用，常用克隆和表達(dá)載體 熟悉內(nèi)容： ? 重組 DNA技術(shù)基本原理和操作步驟，目的基因與載體的連接方法；重組體的篩選方法（藍(lán)白菌落篩選，標(biāo)志補(bǔ)救篩選，抗性標(biāo)志篩選，電泳篩選；克隆基因的表達(dá)。 目錄 演講完畢，謝謝觀看！
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