【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ） ：信號(hào)肽、融合肽②外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)原理A、啟動(dòng)子 (Promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始RNA合成的序列。是基因表達(dá)最關(guān)鍵和最強(qiáng)的表達(dá)調(diào)控元件，啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對(duì)表達(dá)水平有決定性影響。（沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。啟動(dòng)子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無效），有組成型（組成型表達(dá)系統(tǒng)）和誘導(dǎo)型（誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)）二大類。原核基因啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成：（1）Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5—10bp，一般由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。（2）—35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，故稱—35區(qū)，一般由10個(gè)堿基組成。常用原核基因啟動(dòng)子：【lac (乳糖啟動(dòng)子)；trp (色氨酸啟動(dòng)子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子——Ptac = Ptrp 的35區(qū)+ Plac的10區(qū)）；T7啟動(dòng)子】——IPTG誘導(dǎo)；PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動(dòng)子)——溫控（熱誘導(dǎo)），30℃/37℃培養(yǎng)， 42℃誘導(dǎo)。T7啟動(dòng)子——最成功的啟動(dòng)子 T7 啟動(dòng)子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶， RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌RNA 聚合酶的快 5 倍 T7 RNA 聚合酶 ，需要將外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5啟動(dòng)子控制下，IPTG間接誘導(dǎo)）。B、終止子轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象： ，形成長短不一的mRNA混合物。防止轉(zhuǎn)錄過頭策略：A、采用強(qiáng)終止子——大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7amp。噬菌體DNA上的TФ B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)C、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） mRNA 5’端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。SD序列（ShineDalgarno）：位于翻譯起始密碼子上游的68個(gè)核苷酸序列（5’UAAGGAGG 3’），它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3’端區(qū)域3’AUUCCUCC 5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯。D、質(zhì)?？截悢?shù) 策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個(gè)至數(shù)十個(gè)）amp。 調(diào)控重組質(zhì)粒的擴(kuò)增E密碼子 滿足宿主對(duì)密碼子偏愛性的策略:外源基因全合成 amp。 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體：胞內(nèi)高效表達(dá)時(shí)，工程菌因大量合成異源蛋白質(zhì)所形成的水不溶性積聚物。性質(zhì)：致密（密度大于細(xì)胞碎片和所有細(xì)胞器）、還含有標(biāo)記蛋白、RNA聚合酶和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。包涵體形成原因：大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)呈“還原”型環(huán)境，不不利于二硫鍵的形成，當(dāng)高效表達(dá)時(shí)，新合成肽形成二硫鍵的速度和折疊效率跟不上合成速度。表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：a)部分屬于折疊過程中的產(chǎn)物；b)部分為無序卷曲與聚集，分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配。 c)分子間存在大量錯(cuò)配二硫鍵。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：①、便于表達(dá)產(chǎn)物分離——包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來②、利于表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在——在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：——以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%。包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。常采用高濃度變性劑：8M尿素、6MGuC打開各種次級(jí)鍵，以DTT等巰基試劑打開二硫鍵。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：促溶劑 最常用, 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)表面活性劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體的復(fù)性與重折疊：二硫鍵形成（將多肽鏈中被拆開的游離巰基氧化重新形成二硫鍵（關(guān)鍵））；通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)重折疊形成二硫鍵的方式主要有：A化學(xué)氧化法——需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 B二硫鍵交換——需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好包涵體復(fù)性操作的方法：緩慢降低變性劑濃度，并盡量減低蛋白濃度。詳見老師ppt。包涵體的復(fù)性與重折疊的主要挑戰(zhàn)是： 聚集沉淀融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)①目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳 ②目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 ③目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 ④目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 ⑤缺點(diǎn)：融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段用于融合蛋白構(gòu)建的Tag（5種）A、His6 易于親和層析、不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)、無免疫原性 B、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST） 維持良好空間構(gòu)象 C、硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus D、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP） 促進(jìn)分泌 E、內(nèi)含肽（Intein)：類似內(nèi)含子的多肽，與目的能蛋白融合表達(dá)，在表達(dá)后可進(jìn)行自剪接，兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性。4℃、DTT條件下切割。目的蛋白的回收⑴化學(xué)裂解法溴化氰（CNBr）法原理： CNBr與Met的硫醚基反應(yīng)，生成高絲氨酸(HMS)殘基留于上游肽段C端基因操作：在二個(gè)多肽基因融合處設(shè)置Met的密碼子⑵酶促裂解法原理：利用蛋白酶的專一性識(shí)別殘基與位點(diǎn)切開融合肽基因操作：在二個(gè)多肽基因融合處設(shè)置蛋白酶識(shí)別殘基的密碼子常用多殘基識(shí)別位點(diǎn)蛋白酶Thrombin(凝血酶） LeuValProArg▼GlySerEnterokinase（腸激酶） AspAspAspAspLys▼Factor Xa （X因子） IleGlu/AspGlyArg▼PreScission（5℃切割！GE） LeuGluValLeuPheGln▼GlyPro TEV protease（Invitrogen) GluAsnLeuTyrPheGln▼GlyIntein（內(nèi)含肽，自切割，NEB） dithiothreitol cleavage ！分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制A、 在信號(hào)肽牽引下跨膜，進(jìn)入周質(zhì)腔；B、信號(hào)肽酶切下信號(hào)肽，釋放目的蛋白于周質(zhì)腔。以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)A、分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：①目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質(zhì)為氧化型環(huán)境，利于二硫鍵形成）②目的蛋白穩(wěn)定性高（周質(zhì)腔蛋白酶少）③目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去 B分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因即便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)水平通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。主要用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備。寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)① 穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽——短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，易受蛋白酶攻擊，易降解，串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，可抗蛋白酶降解。②目的蛋白高效表達(dá)——在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù) ③目的產(chǎn)物回收困難四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化(1)工程菌構(gòu)建與分析(2)工程菌遺傳穩(wěn)定性分析 在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對(duì)工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進(jìn)行一下三項(xiàng)分析： A、存在狀況：宏觀逃逸率 B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析 C、功能完整性：表達(dá)水平工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性（主要）：整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失重組質(zhì)粒的逃逸：工程菌部分細(xì)胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象。重組質(zhì)粒逃逸的原因①目的基因本底表達(dá)產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng)——關(guān)閉質(zhì)粒DNA合成途徑，啟動(dòng)降解程序②目的基因高效表達(dá)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng) ③抗性標(biāo)記基因過表達(dá)，抗生素消耗過快。④目的基因表達(dá)盒“轉(zhuǎn)錄過頭”，影響Ori區(qū)域。⑤☆環(huán)境因素誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒滲漏——高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率：工程菌培養(yǎng)液中丟失質(zhì)粒的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比?！?宏觀逃逸率（%）=（非選擇性平板菌落數(shù)—選擇性平板菌落數(shù)）/非選擇性平板菌落數(shù)100(3)發(fā)酵工藝研究工程菌生長與表達(dá)主要影響因素培養(yǎng)基：影響菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、表達(dá)水平、產(chǎn)物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應(yīng)避免外源基因表達(dá)的“葡萄糖效應(yīng)”。氮源：有機(jī)氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿 無機(jī)氮： 氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 其他：無機(jī)鹽、微量元素維生素、生物素等菌齡與接種量菌齡：自接種起培養(yǎng)的時(shí)間（小時(shí)） 影響停滯期、質(zhì)粒宏觀逃逸率接種量：是指接入的種子液體積占培養(yǎng)液體積的百分比