【文章內(nèi)容簡介】 基因種類，主要存在于庫斯塔克亞種 (subsp. kurstaki)中，其作用對象也是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中最重要的一類害蟲，如危害蔬菜、棉花、玉米、水稻、煙草以及森林等的鱗翅目昆蟲。 cry3Aa 殺蟲晶體蛋白基因主要來自 Bt 擬步行甲亞種 (subsp. tenebrionis)，它對鞘翅目昆蟲如馬鈴薯甲蟲有特異性毒力，目前開發(fā)的防治鞘翅目昆蟲的 蘇云金芽孢桿菌 殺蟲劑主要由該亞種制備。 通過基因工程技術(shù)改造 Bt 主 要是為了增強殺蟲毒力、拓寬殺蟲范圍、延長持效期、克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性等。 （ 1）增強殺蟲毒力 通過提高某個高毒力殺蟲基因的表達量在一定程度上可增強殺蟲活性。例如將 cry1Ac 殺蟲基因?qū)敫叨玖ιa(chǎn)菌株（一般都是庫斯塔克亞種），可增加其殺蟲活性。為了提高目標基因的表達量，可利用幫助蛋白基因使表達的晶體蛋白更易形成伴胞晶體而提高表達量 ，或通過更換 cry3Aa 殺蟲晶體蛋白基因 的啟動子來克服 ?因子的競爭而提高表達量。我國通過這種方法構(gòu)建的高毒力 Bt 菌株已通過農(nóng)業(yè)基因工程安全審批完成了商品化生產(chǎn)試驗。通過導(dǎo)入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。 （ 2）拓寬殺蟲范圍 Bt 的殺蟲基因的活性范圍各不相同，不同的菌株所含的殺蟲基因的種類和數(shù)量也不同，因此不同菌株的殺蟲活性和殺蟲范圍各不相同。高毒力生產(chǎn)菌株一般對甜菜夜蛾和鞘翅目昆蟲低毒或無毒，將 cry1C 基因或 cry3Aa 基因?qū)霂焖顾藖?種中可擴大其殺蟲譜。相關(guān)的基因工程菌株已有部分進入“環(huán)境釋放”試驗。 （ 3）延長持效期 為了延長持效期，有人將芽孢形成較后階段的基因突變，使殺蟲基因正常表達，但芽孢不能完全成熟，細胞外殼相當于一層生物囊可保護伴胞晶體不受紫外線（ UV）等自然條件的不利影響。 （ 4）克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性 來自以色列亞種的 cyt1A 基因具有克服昆蟲抗性的能力，人們已經(jīng)將該基因?qū)霂焖顾藖喎N中以期延長可能出現(xiàn)的昆蟲抗性問題。 蘇云金芽孢桿菌 表達系統(tǒng) 的構(gòu)建 涉及 以下 方面 ： 首先確定 載體的類型 , 主要是質(zhì)粒載體，同時為了復(fù) 制的穩(wěn)定，一般用 Bt自身質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)作為載體的復(fù)制單元 ，如前面所述的穿梭載體 pHT304。但是，為了最大限度地保證基因工程菌環(huán)境釋放的安全性，要求將載體中的非 Bt來源的 DNA片段去掉，如抗生素抗性基因以及來自大腸桿菌的 DNA片段。 為 此 ，采用了 Bt轉(zhuǎn)座子中的位點特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒的幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復(fù)制而丟失 ，保留來自 Bt的 DNA片段 。這種載體稱為 解離載體 ，其工作過程見圖 165。 345 圖 165 蘇云金芽孢桿菌解離載體的工作原理 erm： 紅霉素抗性基因 ； amp： 氨芐霉素抗性基因 ； ： 大腸桿菌克隆載體復(fù)制起點 ； Res:Bt轉(zhuǎn)座子 Tn4430的重組位點 (解離位點 )；cry1Ac10:殺蟲晶體蛋白基因； ori1030:來自 Bt內(nèi)源質(zhì)粒的復(fù)制區(qū) 。當重組質(zhì)粒 pBMB801進入 Bt菌后，再通過溫度敏感復(fù)制的輔助質(zhì)粒將解離酶基因 tnpI導(dǎo)入重組菌，由此導(dǎo)致兩個 res位點之間發(fā)生重組，從而形成兩個質(zhì)粒。其中 pBMB801B只含有來自 Bt的 DNA片段 且含有質(zhì)粒復(fù)制區(qū)，能夠在 Bt中穩(wěn)定復(fù)制，就像 Bt的內(nèi)源質(zhì)粒一樣； pBMB801E不含在 Bt中的復(fù)制單元，隨著菌體的復(fù)制而逐漸消失。 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的遺傳操作 農(nóng)用抗生素是由抗生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的具有農(nóng)藥功能的次生代謝物質(zhì)，它是有明確分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，如 阿維菌素（ Avermectin） 、 鏈霉素 (Streptomycin)和 日光霉素 (Nikkomycin)等，具有殺蟲、殺螨、殺線蟲或殺真菌活性。 阿維菌素是目前世界上有關(guān)生物合成基因簇研究 得 最為深入的抗生素之一， 產(chǎn)生阿維菌素的 阿維鏈霉菌（ Streptomyces avermitilis） 的全基因組測序已經(jīng)完成， 在利用基因工程進行抗生素的人工改造方面已有了許多成功的范例。 我國通過缺失其生物合成途徑中的 C50甲基轉(zhuǎn)移酶而阻斷支路代謝，獲得了僅產(chǎn) B 組分的工程菌，這種微生物農(nóng)藥更加高效和低毒，還大通過輔助質(zhì)粒導(dǎo)入 tnpI 基因 346 大簡化工藝流程和降低生產(chǎn)成本。 由于 目前有關(guān)鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術(shù)平臺已經(jīng)建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚酮生物合成調(diào)控的分子機理的闡明，人們 已經(jīng) 能 夠 有的放矢地利用抗生素基因簇資源，提高農(nóng)用抗生素產(chǎn)量與品種。 殺蟲抗病重組 微生物 許多細菌具有殺死或抑制植物病原菌的作用，或具有促進植物生長的作用，或在植物的葉面或根部具有優(yōu)勢定殖能力，將殺蟲基因?qū)脒@些細菌，可以獲得改良的殺蟲細菌。例如 熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)對作物病原菌具有抑菌活性 (如對小麥全蝕病菌 )以及較強的根部定殖能力，以這類假單胞菌為受體構(gòu)建的工程菌，能表現(xiàn)出良好的防蟲抗病活性。 有些 枯草芽孢桿菌能穩(wěn)定地在土壤和植物表面定殖 ， 產(chǎn)生抗生素 ， 分泌刺激植物生長的激素 ， 并能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，是一種理想的微生物殺菌劑，有廣闊的應(yīng)用前景。將 Bt殺蚊 晶體蛋白 基因或 cry1A殺蟲晶體蛋白 基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，成功獲得殺蚊和殺蟲并 能 抗水稻紋枯病的重組菌。 4．其它重組殺蟲抗病微生物 微生物種類繁多，生物性狀豐富，構(gòu)建出的殺蟲抗病重組菌也非常多。以下簡要舉例。 （ 1）生物囊殺蟲劑 將 Bt毒素蛋白基因轉(zhuǎn)入螢光假單胞菌中， 使其高效表達并形成伴胞晶體，發(fā)酵后通過物理和化學(xué)方法將菌體殺死但不破壞伴胞晶體而且菌體外形保持完整，從而形成一種生物囊制劑（圖 166），這種制劑在田間應(yīng)用時其有效期平均增加了兩百多倍， 對小菜蛾的殺蟲效果與化學(xué)農(nóng)藥相當，無污染環(huán)境的副 作用，成為一種新型的微生物殺蟲劑，用于蔬菜害蟲防治。 圖 166 螢光假單胞菌 合成蘇云金芽孢桿菌的 伴胞晶體 ， 用于開發(fā)生物囊殺蟲劑 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射農(nóng)桿菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可產(chǎn)生 農(nóng)桿菌素 (agrocin) 84, 其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效地防治根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。但在該菌的質(zhì)粒 pAgK84上含有抗該核苷酸桿菌素的 抗性基因，在應(yīng)用過程中該質(zhì)粒會通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)到病原菌中，從而使病原菌獲得抗性，防病效果大大降低。將該質(zhì)粒上接合轉(zhuǎn)移必需的 tra基因刪掉后構(gòu)建的重組菌可克服這一問題，并開發(fā)成第一個商品化的重組微生物殺菌劑 Nogall，該制劑已在澳大利亞、美國、加拿大等 9個國家推廣應(yīng)用。 （ 3） 殺蟲抗病工程菌 將具有抑制歐文氏菌病原基因表達的 aii基因（ AHL內(nèi)酯酶）通過 S 347 層蛋白為載體在 Bt細胞表面表達，構(gòu)建出殺蟲抗病工程菌，在魔芋田間試驗中表現(xiàn)出對軟腐病菌的良好抗病效果。 轉(zhuǎn)基因殺蟲抗病作物的推廣，無疑對微生物農(nóng)藥 的發(fā)展形成挑戰(zhàn)，但微生物農(nóng)藥具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治對象的多樣性及生產(chǎn) 方式 的靈活性，難以被取代。可以期待微生物防治在低殘毒、難以產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點的基礎(chǔ)上，借助基因工程的方法能合成或創(chuàng)造出更多新的產(chǎn)物以提高生物農(nóng)藥的穩(wěn)定性及作用效率，微生物農(nóng)藥 依 然有著良好的發(fā)展前景。 （ 二 ） 微生物肥料 利用微生物的生命活動及代謝產(chǎn)物的作用，改善作物養(yǎng)分供應(yīng)，為農(nóng)作物提供營養(yǎng)元素、生長物質(zhì)、調(diào)控生長、增強抗逆性，達到提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用、提高土壤肥力 的 一類生物制品就是微生物肥料。這類制品都有一個共同的 特點，即含有一定量的特定功能的微生物，而且這些活體微生物起著重要作用 。微生物肥料的使用可減少化肥用量、減少能源資源消耗。 微生物肥料主要有以下種類：①固氮菌，主要利用自身的固氮能力，將大氣中的氮氣轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟梢晕绽玫匿@鹽等氮源。固氮菌可分為自生固氮菌、共生固氮菌和聯(lián)合固氮菌三類，其中與豆科植物共生的根瘤菌固氮效果最佳，因而使用也最為廣泛。 根瘤菌肥料是世界各國應(yīng)用最多的微生物肥料 。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫目扇苄粤姿猁}。 ③解鉀菌，主要是 膠質(zhì)芽孢桿菌（ Bacillus mucilaginosus,又名硅酸鹽細菌），可把鉀元素從不溶性含鉀礦石中釋放出來，供植物吸收利用。④植物根際促生菌或 植物根圈促生細菌 (PGPR)， 又叫 ―增產(chǎn)菌 ‖或 ―多效菌劑 ‖，這是一類能在植物根部大量定殖的有益菌群，它們可抑制植物病原菌生長。⑤ VA菌根真菌，它是一類與植物根系共生的真菌，幫助植物吸收多種礦質(zhì)營養(yǎng)成分，特別是磷素營養(yǎng)。⑥腐熟劑，主要是加速高分子有機物分解為小分子養(yǎng)分物的腐生菌。⑦光合細菌，如紅螺菌等，它們能夠為作物提供部分碳源和一些有益的代謝物 。⑧復(fù)合菌肥，即將以上菌肥的兩種或多種混合施用，產(chǎn)生比單獨施用更好的效果。 目前，應(yīng)用最廣、影響最大的微生物肥料為基因工程固氮菌。對根瘤菌進行的基因工程研究集中在進一步提高固氮效率和解決 “ 老區(qū)問題”?！袄蠀^(qū)問題 ” 指的是根瘤菌劑接種在從未種植過相應(yīng)豆科植物的“新區(qū)”時增產(chǎn)效果顯著，而在多年種植的“老區(qū)”效果不穩(wěn)定。其主要原因是在“老區(qū)”接種根瘤菌常面臨土著根瘤菌的競爭而降低了占瘤率和共生固氮效率。解決“老區(qū)問題 ” 的方法主要有使接種菌產(chǎn)生能夠抑制土著菌的抗菌素以及導(dǎo)入競爭結(jié)瘤相關(guān)基因增加菌劑的結(jié)瘤能力等。提高根 瘤菌固氮能力的途徑主要有：①提高根瘤菌固氮相關(guān)的固氮酶、吸氫酶等基因的表達水平。②降低土壤中銨離子對根瘤菌固氮能力的抑制作用。③增加宿主對根瘤菌碳源和能源的供應(yīng)。 固氮是一個非常復(fù)雜的過程，需要許多不同蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)作用。 nifA基因是絕大多數(shù)固氮細菌固氮酶基因的正調(diào)節(jié)基因。 NifA蛋白不但能夠與固氮酶基因 nifHDK啟動子結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄效率，而且調(diào)控根瘤菌的結(jié)瘤能力。 nifA基因的突變體不僅造成固氮酶活性的喪失，而且引起結(jié)瘤能力嚴重降低。相反，當引入了多拷貝的 nifA基因后，根瘤菌的固氮酶活性和結(jié)瘤能力都 有顯著的提高。當環(huán) 348 境中存在銨鹽時，根瘤菌的固氮能力就明顯降低，通過研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象是由于銨離子抑制了 nifA基因的表達造成的，由此構(gòu)建了不受銨阻遏的組成型表達的 nifA質(zhì)粒，將其引入根瘤菌中，得到了固氮作用不受銨阻遏的基因工程菌。 在美國，基因組中整合了外源 dctABD基因的重組苜蓿根瘤菌能提高大田苜蓿產(chǎn)量，是世界上首例通過了遺傳工程菌安全性評價并進入有限商品化生產(chǎn)的工程根瘤菌。我國研制的重組 大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum) HN32已 通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價審批進行 環(huán)境釋放，該菌是世界上第二例獲準進行環(huán)境釋放的重組根瘤菌。 二、食品和工業(yè)基因工程菌 （ 一 ） 乳酸菌基因工程菌 乳酸菌是一類以乳酸發(fā)酵為基本特征的革蘭氏陽性菌群 ， 包括 乳酸桿菌 (Lactobacillus)、 乳球菌(Lactococcus)、 鏈球菌 (Streptococcus)、 片球菌 (Pediococcus)和 明串球菌 (Leuconostoc)五個菌屬。乳酸菌具有下列共同特性：都能在較低的 pH值及厭氧條件下良好生長，其生長需要碳水化合物、氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)成分；并能利用碳水化合物生產(chǎn)大量的乳酸，產(chǎn)乳酸量 通常占發(fā)酵最終產(chǎn)物的50%以上；幾乎所有的乳酸菌都是非致病性的。 乳酸菌基因工程的改良主要包括三個方面： ① 提高生產(chǎn)菌在食品發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性。要求工程菌對噬菌體具有抗性，乳糖代謝和蛋白酶合成基因能全程穩(wěn)定表達，從而提高乳糖的利用率，這在奶酪生產(chǎn)中極為重要； ② 改善發(fā)酵食品的品質(zhì)?？刂频鞍酌富虻谋磉_程度可以優(yōu)化發(fā)酵乳制品的組成，提高其營養(yǎng)價值；在生產(chǎn)菌中導(dǎo)入某些天然香料的生物合成基因以及甜味蛋白或多肽基因，可以改善產(chǎn)品的風味和口感； ③ 縮短生產(chǎn)時期。在詳盡了解乳酸桿菌代謝機制的前提下，重新設(shè)計乳糖發(fā)酵與其它細菌生長所必需的代謝途徑之間的物流控制，最大限度地提高生產(chǎn)菌的生長速度，同時阻止乳酸合成途徑或強化表達殺菌素合成途徑，以增加乳制品的保鮮期。 （二） 生產(chǎn)食品添加劑的基因工程菌 1． 氨基酸工程菌 氨基酸在食品工業(yè)具有廣泛的用途，可以用作增鮮劑 (味精 )、抗氧化劑和營養(yǎng)補充劑，在其他行業(yè)用途也很廣泛。目前，全世界每年的氨基酸產(chǎn)量超過百萬噸，銷售額達幾十億美元，其中谷氨酸的產(chǎn)量占氨基酸總產(chǎn)量的一半以上。氨基酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，主 要有蛋白質(zhì)降解和微生物發(fā)酵兩種方法。用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的高產(chǎn)菌株以前是利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)改良 棒桿菌(Corynebacterium spp.)的野生株，現(xiàn)在主要是利用 DNA重組技術(shù)建構(gòu)高產(chǎn)工程菌，相對傳統(tǒng)誘變技術(shù)而言，其優(yōu)點是：①能特異性地高效表達氨基酸生物合成途徑中的限速步驟控制基因；②能將氨基酸的生物合成控制在細菌的最