【正文】 用傳統(tǒng)誘變技術(shù)改良 棒桿菌(Corynebacterium spp.)的野生株，現(xiàn)在主要是利用 DNA重組技術(shù)建構(gòu)高產(chǎn)工程菌，相對傳統(tǒng)誘變技術(shù)而言，其優(yōu)點(diǎn)是：①能特異性地高效表達(dá)氨基酸生物合成途徑中的限速步驟控制基因；②能將氨基酸的生物合成控制在細(xì)菌的最佳生長階段；③能將棒桿菌有效的氨基酸生物合成和分泌系統(tǒng)移植到易于控制培養(yǎng)且生長迅速的其它細(xì)菌 (如大腸桿菌 )中。乳酸菌具有下列共同特性：都能在較低的 pH值及厭氧條件下良好生長，其生長需要碳水化合物、氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)成分；并能利用碳水化合物生產(chǎn)大量的乳酸，產(chǎn)乳酸量 通常占發(fā)酵最終產(chǎn)物的50%以上；幾乎所有的乳酸菌都是非致病性的。 nifA基因是絕大多數(shù)固氮細(xì)菌固氮酶基因的正調(diào)節(jié)基因。對根瘤菌進(jìn)行的基因工程研究集中在進(jìn)一步提高固氮效率和解決 “ 老區(qū)問題”。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫目扇苄粤姿猁}。 轉(zhuǎn)基因殺蟲抗病作物的推廣，無疑對微生物農(nóng)藥 的發(fā)展形成挑戰(zhàn)，但微生物農(nóng)藥具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治對象的多樣性及生產(chǎn) 方式 的靈活性，難以被取代。將 Bt殺蚊 晶體蛋白 基因或 cry1A殺蟲晶體蛋白 基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，成功獲得殺蚊和殺蟲并 能 抗水稻紋枯病的重組菌。其中 pBMB801B只含有來自 Bt的 DNA片段 且含有質(zhì)粒復(fù)制區(qū)，能夠在 Bt中穩(wěn)定復(fù)制，就像 Bt的內(nèi)源質(zhì)粒一樣； pBMB801E不含在 Bt中的復(fù)制單元，隨著菌體的復(fù)制而逐漸消失。 （ 3）延長持效期 為了延長持效期，有人將芽孢形成較后階段的基因突變，使殺蟲基因正常表達(dá)，但芽孢不能完全成熟，細(xì)胞外殼相當(dāng)于一層生物囊可保護(hù)伴胞晶體不受紫外線（ UV）等自然條件的不利影響。 （ 1）增強(qiáng)殺蟲毒力 通過提高某個高毒力殺蟲基因的表達(dá)量在一定程度上可增強(qiáng)殺蟲活性。 近幾年來， 微生物 基因工程 農(nóng)藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉(zhuǎn)基因 植物進(jìn)入了實(shí)用化階段。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動物、植物甚至源于人類的基因，轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細(xì)菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細(xì)菌。比如利用細(xì)胞表面技術(shù)開發(fā)細(xì)胞催化劑的時候，細(xì)胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構(gòu)建細(xì)胞表面蛋白庫的時候，有些蛋白的表達(dá)量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達(dá)、多種外源蛋白的同時表達(dá)等問題。 整合載體 pDG1730的整合是有針對性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構(gòu)建，以及用于其它細(xì)菌整合載體的構(gòu)建。②具有一個雜合啟動子，它來源于乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動子 (p)的控制之下。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)，但是目前對其他微生物在遺傳和分子生物學(xué)方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運(yùn)的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應(yīng)用于其他一些微生物。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細(xì)菌改造成蛋白質(zhì)分泌型。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細(xì)胞的翻譯。在細(xì)菌的代謝工程中，常見這種情況。對于克隆載體，只要滿足在宿主菌中復(fù)制和選擇要求的載體，都可用作克隆載體。在細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，大腸桿菌主要作為外源蛋白超量表達(dá)的平臺，其主要目的是對不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外超量表達(dá)，從而可以 將目標(biāo)蛋白用于不同的下游領(lǐng)域，如制備基因工程疫苗、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等等。同時要注意革新細(xì)菌基因工程菌的生產(chǎn)工藝，發(fā)展適用的加工劑型，盡快提高 ―下游 ‖技術(shù)的水平。目前至少有 70多個國家在研究、生產(chǎn)和使用微生物肥料，主要以根瘤菌劑和 植物促長細(xì)菌（ plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR） 制劑為主。 細(xì)菌工程菌與農(nóng) 業(yè)生產(chǎn) 各類農(nóng)業(yè)微生物的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有力保證。但已有少數(shù) 氨基酸、有機(jī)酸 及維生素 等重要發(fā)酵產(chǎn)品 是以基因工程菌 代替現(xiàn)有的菌種進(jìn)行 工業(yè)化生產(chǎn)，并 獲得了巨大成功 。與化學(xué)、物理等其他技術(shù)相比，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)具有效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和以及無二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，同時還可以增強(qiáng)自然環(huán)境的自我凈化能力。 二十三年以來 基因工程 的 技術(shù)成果６０％集中應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)，為生物醫(yī)藥的發(fā)展帶來一場 嶄 新的革命 。 334 第十六章 細(xì)菌基因工程 第一節(jié) 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 一、細(xì)菌基因工程的發(fā)展簡史 細(xì)菌與基因工程密不可分。 二、 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀 細(xì)菌工程菌與人類藥物生產(chǎn) 1982年美國首先將重組胰島素投放市場，標(biāo)志著世界第一個基因工程藥物的誕生。它主要采用現(xiàn)代分 子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)的原理和方法，充分利用環(huán)境微生物的生物凈化、生物轉(zhuǎn)化和生物催化等特性的功能基因，構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌進(jìn)行污染治理、清潔生產(chǎn)和可再生資源利用，多層面和全方位地解決工業(yè)和生活廢棄物污染、石油和煤炭脫硫、農(nóng)藥殘留、能源和材料短缺等問 題。理論上所有發(fā)酵食品與食品配料生產(chǎn)菌，都可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良，但是由于氨基酸、有機(jī)酸、維生素、色素、香料等均屬于微生物代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)菌的遺傳改造所涉及的基因較多且調(diào)控復(fù)雜，因此增加了利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良的難度，目前這方面的工作大多還處于研究階段。在許多工業(yè)領(lǐng)域里，通過這些方法得到的產(chǎn)品每年都在遞增。國際水稻研究所計(jì)劃在 10年的時間內(nèi)構(gòu)建一種超級固氮細(xì)菌，以減少水稻 50%的氮肥用量。細(xì)菌基因工程的研究重 337 點(diǎn)將會放在細(xì)菌資源的發(fā)掘和利用上，即從現(xiàn)存豐富的細(xì)菌資源中鑒定分離具有殺菌、殺蟲、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物 、促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等各種功能的新基因，以及難培養(yǎng)和極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用，為構(gòu)建多方位滿足人類需要的基因工程菌打下牢固基礎(chǔ)。 大腸桿菌是目前研究最深入、使用最廣泛的基因工程宿主菌。因此，表達(dá)載體的構(gòu)建主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。在這種情況下，不一定要高量表達(dá)，正常表達(dá)就可，往往可采用基因自身的啟動子或宿主 菌的相關(guān)性狀基因的啟動子。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個核苷酸應(yīng)該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。因此可使用革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物細(xì)胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基。 四、常見細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達(dá)的理想微生物。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個 BglII 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；復(fù)制起點(diǎn) (ori)；啟動子 (p)；多克隆位點(diǎn) (MCS)。 pDG148Stu克隆表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因 lacI及其調(diào)控序列，使外源蛋白的表達(dá)受 IPTG的調(diào)控。只有當(dāng)載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗性基因 （ spc） 替換染色體上同源序列之間的區(qū)域，整合到染色體后， 壯觀霉素的抗性才能表現(xiàn)出來。 盡管現(xiàn)在已經(jīng)成功開發(fā)了一些細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多問題需要解決。還 有一類中間狀態(tài)的類型，即基因工程改造的是細(xì)菌本身，但需要的是產(chǎn)物或改造的產(chǎn)物， 通常為了得到某些高表達(dá)量的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，會對某些細(xì)菌進(jìn)行必要的遺傳學(xué)改造，將某些與目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)入到合適的細(xì)菌，這就相當(dāng)于在宿主菌中重新載入了或加強(qiáng)了某條生理代謝途徑，從而在宿主細(xì)菌中得到理想的細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物， 如通過基因工程改造后提高某種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或去除了雜質(zhì)產(chǎn)物，或產(chǎn)生一種新的代謝產(chǎn)物（如鏈霉菌中的新抗生素的合成）等。 此外還有其他來源的 蝎毒基因 aaIT、桿狀病毒 egt 基因、白葉枯病菌致病基 因 hrp、抗馬鈴薯晚疫病的 osmotin 基因、病毒增效因子序列、桿狀病毒抗凋亡基因、幾丁質(zhì)酶基因 等 。 通過基因工程技術(shù)改造 Bt 主 要是為了增強(qiáng)殺蟲毒力、拓寬殺蟲范圍、延長持效期、克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性等。相關(guān)的基因工程菌株已有部分進(jìn)入“環(huán)境釋放”試驗(yàn)。當(dāng)重組質(zhì)粒 pBMB801進(jìn)入 Bt菌后，再通過溫度敏感復(fù)制的輔助質(zhì)粒將解離酶基因 tnpI導(dǎo)入重組菌，由此導(dǎo)致兩個 res位點(diǎn)之間發(fā)生重組，從而形成兩個質(zhì)粒。 有些 枯草芽孢桿菌能穩(wěn)定地在土壤和植物表面定殖 ， 產(chǎn)生抗生素 ， 分泌刺激植物生長的激素 ， 并能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，是一種理想的微生物殺菌劑，有廣闊的應(yīng)用前景。 （ 3） 殺蟲抗病工程菌 將具有抑制歐文氏菌病原基因表達(dá)的 aii基因（ AHL內(nèi)酯酶）通過 S 347 層蛋白為載體在 Bt細(xì)胞表面表達(dá)，構(gòu)建出殺蟲抗病工程菌，在魔芋田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出對軟腐病菌的良好抗病效果。 根瘤菌肥料是世界各國應(yīng)用最多的微生物肥料 。 目前，應(yīng)用最廣、影響最大的微生物肥料為基因工程固氮菌。 固氮是一個非常復(fù)雜的過程，需要許多不同蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)作用。 二、食品和工業(yè)基因工程菌 （ 一 ） 乳酸菌基因工程菌 乳酸菌是一類以乳酸發(fā)酵為基本特征的革蘭氏陽性菌群 ， 包括 乳酸桿菌 (Lactobacillus)、 乳球菌(Lactococcus)、 鏈球菌 (Streptococcus)、 片球菌 (Pediococcus)和 明串球菌 (Leuconostoc)五個菌屬。氨基酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，主 要有蛋白質(zhì)降解和微生物發(fā)酵兩種方法。與此同時，高產(chǎn)蘇氨酸的棒桿菌基因工程菌的建構(gòu)也獲得成功，產(chǎn)率達(dá)到 33 g/L以上。吲哚在副反應(yīng)中產(chǎn)生，并在色氨酸合成酶作用下轉(zhuǎn)化為色氨酸 （ 2） L半胱氨酸高產(chǎn)菌的建構(gòu) L半胱氨酸是藥物、食品和化妝品工業(yè)中最重要的氨基酸之一，傳統(tǒng)方法是通過酸 水解人和動物的毛發(fā)提取。由于共發(fā)酵的兩種微生物的適宜溫度、生長條件與 pH 可能不同，易出現(xiàn)不相容性，利用基因工程技術(shù)從棒桿菌中分離 2,5DKG 還原酶基因并在草生歐文菌中表達(dá)后，可以使代謝途徑完全不同的兩種微生物合而為一， L抗壞血酸的生產(chǎn)因此大大簡化。美國已有高達(dá) 70%的干酪是以轉(zhuǎn)基因微生物所生產(chǎn)的凝乳酶加工制造的。 將耐熱 的 嗜熱 脂肪芽 孢桿菌 (B. stearothermophilus)的 α淀粉酶基因轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿 菌中，獲得了高產(chǎn)、耐熱 α淀粉酶工程菌。目前，利用基因工程技術(shù)開發(fā)食品用酶的主要目的在于生產(chǎn)具有優(yōu)于現(xiàn)有酶加工特性，且對產(chǎn)品的感官屬性影響不大的酶，但是隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的日新月異，開發(fā)出穩(wěn)定性、特異性與催化效率更佳的酶，將是今后研究的焦點(diǎn)。 353 NN H2C O O HNNO HO HNO HNON色 氨 酸對 吲 哚 2 , 3 二 氫 二 醇AB萘 雙 加 氧 酶自 發(fā) 脫 水二 甲 苯 氧 化 酶O2靛 藍(lán)O吲 哚吲 哚 酚 圖 1610 利用重組大腸桿菌從色氨酸合成靛藍(lán) 大腸桿菌合成色氨酸酶?？寺》蛛x時，先用質(zhì)粒載體構(gòu)建該菌總 DNA的基因文庫，然后將克隆文庫轉(zhuǎn)入大腸桿菌 HB101細(xì)胞，所有克隆子混合液體培養(yǎng)，再用 ?噬菌體感染，對 ?噬菌體感染有抗性的克隆子就是表達(dá)了 PstI限制性內(nèi)切酶的陽性克隆。 1．合成新抗生素 對現(xiàn)有抗生素的生物合成進(jìn)行遺傳操作可以合成具有獨(dú)特性質(zhì)的新抗生素。利用 基因工程 技術(shù) 產(chǎn)生新的 “ 雜種 ” 抗生素 ， 尤其是與聚酮抗生素有關(guān)的 抗生素 研究 已經(jīng) 在吸引越來越多研究者的興趣。 （ 2）轉(zhuǎn)基因產(chǎn)黃頭孢工程菌大量生產(chǎn) 7ACA(7氨基頭孢酸 ) 化合物 7ACA 由頭孢菌素 C 合成 (圖 1611)，是許多頭孢烯類抗生素 (頭孢菌素 )合成的起始物質(zhì)，但幾乎沒有已知微生物可以合成7ACA。土壤污染不但直接表現(xiàn)為土壤生產(chǎn)力的下降，而且也通過以土壤為起點(diǎn)的土壤、植物、動物、人體之間的鏈，使某些微量和超微量的有害污染物在農(nóng)產(chǎn)品中富集，對人類和動植物產(chǎn)生嚴(yán)重危害。金屬硫蛋白是真核生物中一類富含半胱氨酸的小肽（約 60個氨 基酸），它能夠結(jié)合金屬離子（如 Zn2+， Cd2+， Hg2+）。從污染環(huán)境中已分離到高效降解細(xì)菌，如苯酚降解菌、苯胺降解菌、萘降解菌以及對偶氮染料、蒽醌染料和三苯基甲烷染料均具有脫色能力的廣譜脫色菌。在制漿過程中，紙漿中殘留的木質(zhì)素與木聚糖形成復(fù)合體緊密地附著在纖維上，影響紙張的白度和強(qiáng)度。為了降低汽柴油 中硫含量，生產(chǎn)環(huán)境友好的清潔燃料，解決汽車尾氣污染問題，必須開發(fā)深度脫硫的汽柴油生產(chǎn)新技術(shù)。 （ 六 ） 合成友好可再生材料的微生物工程菌 合成生物可降解塑料的基因工程菌 在自然界中許多種類的微生物如球菌、桿菌、能進(jìn)行光合作用的細(xì)菌、好氧類群及有機(jī)營養(yǎng)細(xì)菌等 ，尤其是真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 在不平衡生長 （ 如氮或磷不足 ） 條件下 ， 以顆粒狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)儲存的各種生物高分子聚合物 統(tǒng)稱為 聚羥基脂肪酸酯 （ Polyhydroxyalkanoa