【正文】 高產(chǎn)廣譜工程菌，均已通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會審批進(jìn)入安全性評價(jià)的商品化生產(chǎn)階段，標(biāo)志著我國一批擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組微生物農(nóng)藥、肥料和飼料用酶產(chǎn)品已初具 產(chǎn)業(yè)規(guī)模。在美國，轉(zhuǎn) Bt遺傳工程菌用以防治蔬菜害蟲和玉米害蟲的面積分別占總面積的 80%和 50%，銷售額從 80年 代末的 4000萬美元上升到 90年代的 5億多美元。目前至少有 70多個(gè)國家在研究、生產(chǎn)和使用微生物肥料，主要以根瘤菌劑和 植物促長細(xì)菌（ plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR） 制劑為主。在東南亞如菲律賓等國，生物肥料已廣泛應(yīng)用于水稻 等糧食作物的生產(chǎn)。 在農(nóng)業(yè)上，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界各國獲 準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工 程菌環(huán)境釋放總數(shù)的 %，其中受體微生物為細(xì)菌的占 %、病毒 %、真菌 ％。但是，由于自然菌株和傳統(tǒng)技術(shù)本身的一些缺陷與不足，諸如研究周期長、成本高、活性低等，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)微生物的產(chǎn)業(yè)化受到很大限制。 細(xì)菌工程菌與農(nóng) 業(yè)生產(chǎn) 各類農(nóng)業(yè)微生物的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有力保證?，F(xiàn)在的細(xì)菌基因工程完全能夠做到： ① 將次級反應(yīng)轉(zhuǎn)換到主要代謝途徑中； ② 優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量及其產(chǎn)量； ③ 改變初始代謝途徑使之能夠利用更廉價(jià)的原料，或者得到以前未知的新產(chǎn)物； ④ 利用酶的異構(gòu)體特性獲得新的手性分子。這些工業(yè)酶類的市場額（主要是食品、去污劑、紡織、皮革、造紙工業(yè)，而非醫(yī)藥業(yè)）在 2020年就已達(dá)到 2億美元。 芬蘭的一家酒精生產(chǎn)公司首先用基因工程芽孢桿菌生產(chǎn) ?淀粉酶 (?amylase)，取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。但已有少數(shù) 氨基酸、有機(jī)酸 及維生素 等重要發(fā)酵產(chǎn)品 是以基因工程菌 代替現(xiàn)有的菌種進(jìn)行 工業(yè)化生產(chǎn)，并 獲得了巨大成功 。食品生產(chǎn)加工過程中要應(yīng)用的許多食品添加劑或加工助劑，例如酶 制劑、氨基酸、維生素、增稠劑、有機(jī)酸、乳化劑、表面活性劑、食用色素、食用香精及調(diào)味料等，都可以采用發(fā)酵生產(chǎn)而得到。在工業(yè)和生活廢水治理、重金屬污染土壤的 生物修復(fù) (bioremediation)、農(nóng)藥殘留的微生物降解、生物制漿和生物漂白等清潔生產(chǎn)技術(shù)的建立、石油污染的消除以及友好可再生 材料的合成等諸多方面，環(huán)境微生物基因工程菌取得了很大的技術(shù)突破，推動了傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)工藝革新和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，保護(hù)了環(huán)境，維持了地球生態(tài)環(huán)境的平衡。 美國科學(xué)家已用基因工程將攜帶不同降解能力的質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入同一個(gè)細(xì)菌中，從而培育出了一種能同時(shí)降解四種烴類的 “超級工程菌” (superbug)。與化學(xué)、物理等其他技術(shù)相比，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)具有效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和以及無二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以增強(qiáng)自然環(huán)境的自我凈化能力。 利用環(huán)境微生物基因工程技術(shù)治理環(huán)境污染和遏制生態(tài)惡化趨勢、促進(jìn)自然資源的可持續(xù)利用，是一條最安全和最徹底消除污染的行之有效途徑。 未來市場前景廣闊的藥 品 將集中 在 單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物和疫苗 等五 個(gè)類別中 ， 其中單克隆抗體的市場需求最令人注目，當(dāng)前處于臨床試驗(yàn)的各類單克隆抗體約 100個(gè)， 約 占在研生物技術(shù)藥品 總 數(shù)的 25%，目前全球單克隆抗體市場銷售額已達(dá)到 40億美元。 ④ 生產(chǎn)天然稀有的醫(yī)用活性多肽或蛋白質(zhì)，例如用于抗病毒、抗腫瘤的藥物干擾素和白細(xì)胞介素；用于治療心血管系統(tǒng)疾病的尿激酶原和組織型溶纖蛋白酶原激活因子；用于防治傳染病的多種疫苗 (如乙型 肝炎疫苗和腹瀉疫苗 )；用于體內(nèi)起調(diào)節(jié)作用的胰島素和其它生長激素等等。 二十三年以來 基因工程 的 技術(shù)成果６０％集中應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)，為生物醫(yī)藥的發(fā)展帶來一場 嶄 新的革命 。 現(xiàn)在則可以將源于微生物、動物或植物甚至源于人 類的基因，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、根瘤菌等細(xì)菌中，獲得具有特殊性狀的基因工程菌，它們在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用十分廣泛，發(fā)展勢頭強(qiáng)勁。 細(xì)菌不僅在現(xiàn)代生物技術(shù)的核心 —基因重組技術(shù)的誕生和技術(shù)進(jìn)步中起到舉足輕重的作用，而且細(xì)菌的遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實(shí)際應(yīng)用成果最多的領(lǐng)域。 1973年，波依爾 (Boyer)和科恩 (Cohen)首次完成外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)室里實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移，為基因 工程開啟了通向現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的大門，使人們有可能按照自己的意愿利用重組 DNA技術(shù)改造和設(shè)計(jì)新的生命體。 334 第十六章 細(xì)菌基因工程 第一節(jié) 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 一、細(xì)菌基因工程的發(fā)展簡史 細(xì)菌與基因工程密不可分。細(xì)菌是單細(xì)胞、結(jié)構(gòu)簡單的原核微生物，目前對其生理代謝途徑以及基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究較為透徹；細(xì)菌的 物種和代謝類型多種多樣 ， 對環(huán)境因子敏感，易于獲得各類突變株； 并且細(xì)菌最顯著的特征是生長速度快，便于大規(guī)模培養(yǎng)，容易進(jìn)行遺傳操作等，因此基因重組技術(shù)首先在細(xì)菌中獲得成功并得到廣泛應(yīng)用。幾年后，第一個(gè)基因工程產(chǎn)品 ──利用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)人胰島素獲得成功，從此人類進(jìn)入了生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)時(shí)代。 在細(xì)菌基因工程誕生之前，人們主要通過誘變來提高產(chǎn)量或者通過控制代謝途徑而在有限程度上改變產(chǎn)品的性質(zhì)。 二、 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀 細(xì)菌工程菌與人類藥物生產(chǎn) 1982年美國首先將重組胰島素投放市場，標(biāo)志著世界第一個(gè)基因工程藥物的誕生。 細(xì)菌是生產(chǎn)蛋白藥物的最好生物反應(yīng)器 ， 利用細(xì)菌基因重組技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)： ① 對化 學(xué)方法難以合成的中間體進(jìn)行合成，從而生產(chǎn)活力更強(qiáng)的衍生物，例如更高效的抗腫瘤藥物羥基喜樹堿和前列腺素；② 使微生物產(chǎn)生新的合成途徑，從而獲得新的代謝產(chǎn)物，例如去甲基四環(huán)素等； ③ 利用微生物產(chǎn)生的酶，對藥物進(jìn)行化學(xué)修飾，例如多種半合成青霉素的生產(chǎn)。 細(xì)菌 基因工程藥物 已 成為制藥行業(yè)的一支奇兵， 基因 工程 制 藥 已 成為 21世紀(jì) 制 藥業(yè)的支柱。 335 細(xì)菌工程菌與環(huán)境保護(hù) 當(dāng)人類越來越深刻地意識到保護(hù)環(huán)境的重要性時(shí)，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)作 為環(huán)境保護(hù)的最有力和最有效的技術(shù)手段，應(yīng)運(yùn)而生，引起各國政府、科技界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛重視，得到了前所未有的關(guān)注和發(fā)展。它主要采用現(xiàn)代分 子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)的原理和方法，充分利用環(huán)境微生物的生物凈化、生物轉(zhuǎn)化和生物催化等特性的功能基因，構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌進(jìn)行污染治理、清潔生產(chǎn)和可再生資源利用，多層面和全方位地解決工業(yè)和生活廢棄物污染、石油和煤炭脫硫、農(nóng)藥殘留、能源和材料短缺等問 題。 目前環(huán)保細(xì)菌基因工程菌的應(yīng)用已有不少成功的例子。分解其它有機(jī)物甚至 致癌物、有機(jī)汞以及有 效固定環(huán)境中重金屬離子的工程菌也展現(xiàn)在世人面前。 細(xì)菌工程菌與食品、飼料及其他工業(yè) 在發(fā)酵工業(yè)上，利用生物技術(shù)構(gòu)建的品質(zhì)優(yōu)良的食用乳酸桿菌提高了生產(chǎn)菌在食品發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性，改善了發(fā)酵食品的質(zhì)量并且降低了成本，大大縮短生產(chǎn)周期，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會效益。理論上所有發(fā)酵食品與食品配料生產(chǎn)菌，都可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良，但是由于氨基酸、有機(jī)酸、維生素、色素、香料等均屬于微生物代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)菌的遺傳改造所涉及的基因較多且調(diào)控復(fù)雜，因此增加了利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良的難度，目前這方面的工作大多還處于研究階段。相對而言，酶制劑的合成所 涉及的基因較為單純，適合利用基因工程技術(shù)進(jìn)行改良。除食品用酶制劑外， 細(xì)菌基因工程菌也已成功應(yīng)用于生產(chǎn)其他不同目的的酶，如用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶； 應(yīng)用于 PCR的耐熱 DNA聚合酶； 用于生產(chǎn)青霉素母核的青霉素?；福迷谙匆路壑械膲A性蛋白酶以及飼料用酶。 336 在過去的二十年里，重組細(xì)菌參與 的全新的或者說是更高效的生產(chǎn)過程已經(jīng)投入工業(yè)應(yīng)用，純度更高、成本更低廉的以及用傳統(tǒng)化學(xué)方法不能得到的物質(zhì)被大量生產(chǎn)出來。在許多工業(yè)領(lǐng)域里，通過這些方法得到的產(chǎn)品每年都在遞增。在自然菌株選育的基礎(chǔ)上開發(fā)微生物農(nóng)藥、肥料、飼料與食品用酶制劑已有悠久的歷史，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給農(nóng)業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是近年來基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，使農(nóng)業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域中最為活躍、最具創(chuàng)新性的前沿之一。美國環(huán)境保護(hù)局 (EPA)和美國農(nóng)業(yè)部 (USDA)批準(zhǔn)環(huán)境釋放的微生物遺傳工程菌涉及十幾種微生物約 50例左右，基因組中整合了外源 dctABD基因、能提高苜蓿共生固氮能力和大田產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因重組苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)是目前世界上首例通過了遺傳工程菌安全性評價(jià)并進(jìn)入有限商品化生產(chǎn)的工程根瘤菌。國際水稻研究所計(jì)劃在 10年的時(shí)間內(nèi)構(gòu)建一種超級固氮細(xì)菌，以減少水稻 50%的氮肥用量。 20世紀(jì) 90年代以來，以 蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis, 簡稱Bt)為龍頭的微生物工程殺蟲劑迅速發(fā)展。 目前，中國是世界上農(nóng)業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國家，在我國境內(nèi)申報(bào)并通過農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會批準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)重組微生物在 40例以上，目前還有十余株轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處于安全性評價(jià)和田間試驗(yàn)階段。 三、 細(xì)菌基因工程的發(fā)展趨勢及 前景展望 隨著基礎(chǔ)生物科學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的突飛猛進(jìn)，特別是隨著人類對包括細(xì)菌在內(nèi)的各種生物的基因組研究的深入，為揭示各類生物基因結(jié)構(gòu)與功能提供了大規(guī)模、高通量和自動化的研究手段和全新思路，細(xì)菌基因工程研究的范圍也進(jìn)一步拓寬。細(xì)菌基因工程的研究重 337 點(diǎn)將會放在細(xì)菌資源的發(fā)掘和利用上，即從現(xiàn)存豐富的細(xì)菌資源中鑒定分離具有殺菌、殺蟲、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物 、促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等各種功能的新基因，以及難培養(yǎng)和極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用，為構(gòu)建多方位滿足人類需要的基因工程菌打下牢固基礎(chǔ)。 此外，在積極促進(jìn)細(xì)菌重組技術(shù)發(fā)展的同時(shí)也要高度重視和預(yù)防轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對健康和環(huán)境可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。 第二節(jié) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 一、細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)由三部分組成：外源基因、表達(dá)載體和宿主 細(xì)菌。 要使克隆的外源基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，首先需要構(gòu)建專門的 表達(dá)載體 (expression vector)用來控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及克隆基因產(chǎn)物的分泌等遺傳元件。 大腸桿菌是目前研究最深入、使用最廣泛的基因工程宿主菌。 其它一些宿主體系如枯草芽孢桿菌、酵母及動物、植物、昆蟲細(xì)胞 以至動植物個(gè)體 等，也可以用來表達(dá)某些克隆基因。本節(jié)主要介紹細(xì)菌基因工程中 構(gòu)建表達(dá)載體的一般原則及其它 常見的一些表達(dá)系統(tǒng)。目前在大腸桿菌和酵母中使用的表達(dá)載體種 類繁多，形成了最成熟的表達(dá)系統(tǒng)。因此，表達(dá)載體的構(gòu)建主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。大腸桿菌以外的細(xì)菌中應(yīng)用的克隆載體一般都是穿梭載體，都含有大腸桿菌克隆載體的序列，便于在大腸桿菌中擴(kuò)增和制備?？寺≥d體可以是質(zhì)粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合載體。如在大腸桿菌中常用 lac、 tac和 T7等可調(diào)控強(qiáng)啟動子，在適當(dāng)?shù)臈l件下都可以使外源基因高水平表達(dá)。在這種情況下，不一定要高量表達(dá)，正常表達(dá)就可，往往可采用基因自身的啟動子或宿主 菌的相關(guān)性狀基因的啟動子。例如， 2酮 L古龍?zhí)撬?(2KLG)是商業(yè)合成維生素 C的中間物，但 草生歐文氏菌 (Erwinia herbricola)只能將 D葡萄糖轉(zhuǎn)化成 2,5二酮 L古龍?zhí)撬?(2,5DKG)，缺乏進(jìn)一步轉(zhuǎn)化 2,5DKG的還原酶基因。詳細(xì)內(nèi)容見后文。也可在終止密碼子后增加終止子序列，使轉(zhuǎn)錄有效終止，并延長 mRNA的半衰期。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個(gè)核苷酸應(yīng)該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。 三、外源基因表達(dá)的方式 1． 外源基因以 融合 蛋白形式表達(dá) 融合表達(dá)是指目標(biāo)基因與 編碼 具有特殊活性的 多肽或蛋白質(zhì)的基因 融合，構(gòu)建成一個(gè)融合蛋白基因。 利用tag的特性通?？梢詫θ诤系鞍走M(jìn)行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達(dá) 既 可以保護(hù)外源蛋白不受宿主內(nèi)蛋白酶的降解，同時(shí)也大大 簡化 了 重組蛋白的純化 過程 。通過基因操作 可在 外源蛋白的 N 端 添加編碼信號肽的 DNA 序列，形成一個(gè)分泌蛋白。因此可使用革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物細(xì)胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基。 3．外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá) 339 包涵體是致密的不溶性復(fù)合物，含有大部分的表達(dá)蛋白， 可以抵抗宿主細(xì)胞中蛋白水解酶的降解，也便于純化。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對之進(jìn)行初級純化。然而 這種方法 也有缺陷 ，經(jīng)變性 /復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時(shí)會很低，更有些蛋白尤其是 分子量較 大 的 蛋白基本上不能正確進(jìn)行重折疊， 目前研究人員正在努力尋求出一種穩(wěn)定 、 高效表達(dá)的技術(shù) 以 獲得具有天然構(gòu)象和高活性的蛋白質(zhì)。 四、常見細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達(dá)的理想微生物。因此，其他細(xì)菌沒有可專門利用的通用型表達(dá)載體，通常研究者只有在使用它們時(shí)才構(gòu)建特異性或?qū)Ｒ恍缘谋磉_(dá)載體。 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體如 pA