基因工程11大腸桿菌基因工程-展示頁(yè)
2025-06-04 06:00本頁(yè)面
【正文】 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在特定生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體（ Inclusion Bodies，IB）。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。例如，在 人尿激酶原 cDNA的 412個(gè)密碼子中，共含有 22個(gè) 精氨酸密碼子 ，其中 7個(gè) AGG、 2個(gè) AGA， 而大腸桿菌受體細(xì)胞中 tRNAAGG和 tRNAAGA的豐度較低。 ?基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基組成也較重要 ， 這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) 。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。第十三章 大腸桿菌基因工程 D 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 大腸桿菌基因工程 C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 B 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 A 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 E 利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素 A 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，共有 4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國(guó) FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì) 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素 B 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)?？截悢?shù) 啟動(dòng)子 啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè) 目的基因 E E A E E 啟動(dòng)子 A 酶切開(kāi) Bal31酶解 目的基因 啟動(dòng)子的構(gòu)建 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 啟動(dòng)子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá) ， 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象 ， 即 RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA序列 ， 形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物 。 很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá) ， 其原因如下： ?轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需時(shí)間就相應(yīng)增加 ， 外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； ?如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它功能 ， 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； ?過(guò)長(zhǎng)的 mRNA往往產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； ?過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA操縱子上的 rrnT1T2以及 T7噬菌體 DNA上的 Tf。mRNA翻譯的起始效率主要由其 5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點(diǎn) （ RBS） 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素： ?位于翻譯起始密碼子上游的 68個(gè)核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’， 即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它識(shí)別并與 16S rRNA 3’端的 3’ AUUCCUCC 5’ 專(zhuān)一性結(jié)合 ， 將 mRNA定位于核糖體上 ，從而啟動(dòng)翻譯； ?翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)； ?SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離重要而堿基組成不重要 ；在很多情況下 ， SD序列位于 AUG之前大約 七個(gè)堿基 處 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) 生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 fX174） 基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G或 C的簡(jiǎn)并密碼子占 90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì) 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 如 GGG、 CCC、 GCG、GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少；如 GUG、 CAC、UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UU
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1