基因工程原理與技術(shù)-植物基因工程-展示頁
2024-09-26 20:45本頁面
【正文】 ⑥ TDNA整合到植物染色體上。 T鏈復(fù)合體 是指結(jié)合了 VirD VirE2蛋白的 T鏈。 VirH蛋白功能是 降解植物傷口細(xì)胞產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)。 VirF蛋白 (23kD)參與 T鏈復(fù)合體的運(yùn)輸。 VirE2蛋白()是 ssDNA結(jié)合蛋白，與 T鏈結(jié)合，參與 T鏈復(fù)合體形成，還具有核定位信號，引導(dǎo) T鏈復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞核。 VirD2與 T鏈的 5’端共價(jià)結(jié)合，并核定位信號，將 T鏈復(fù)合體導(dǎo)向細(xì)胞核。 virD操縱子 ：誘導(dǎo)型， virD1~virD4基因。 virC操縱子 ：誘導(dǎo)型， virC virC2基因。 virB操縱子 ：誘導(dǎo)型， virB1~virB11基因。 virG操縱子 ：組成型， ， virG基因。 virA操縱子 ：組成型，長約為 ， virA基因。 功能區(qū) 毒性區(qū) (Vir區(qū) ) TDNA區(qū) 接合轉(zhuǎn)移區(qū) 復(fù)制起始區(qū) 致毒區(qū) Ti 質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn) 冠癭堿代謝 酶編碼基因 與 Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移功能 有關(guān)的遺傳座位 冠癭堿合成基因 T D N A 區(qū) 右邊界 生長素合成基因 細(xì)胞分裂素合成基因 左邊界 章魚堿型 TDNA的結(jié)構(gòu)與功能 邊界序列： 25bp， TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右邊界序列是完全保守的，對 TDNA轉(zhuǎn)移是必須的。 二、 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和功能 Ti質(zhì)粒的類型與分區(qū) 環(huán)狀雙鏈 DNA分子， 140~235 kb。 生長條件 最適溫度： 25~30℃ ， 28℃ 培養(yǎng)；最適 pH： ~ 宿主植物 雙子葉植物、裸子植物 侵染宿主的癥狀及原因 冠癭瘤， Ti質(zhì)粒 (tumor inducing plasmid)的 TDNA。植物基因工程 1983年，首次獲得轉(zhuǎn)基因植物 —— 轉(zhuǎn)基因煙草 現(xiàn)在，已獲得 200多種植物的轉(zhuǎn)基因植株。 第一節(jié) 農(nóng)桿菌及其轉(zhuǎn)化體系 一、根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciences)的生物學(xué)特征 形態(tài) 細(xì)胞呈桿狀，大小為 um ~， 1~4根周生鞭毛，菌落無色、光滑。 TDNA是指農(nóng)桿菌質(zhì)粒上一段能轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的 DNA片段。 根據(jù)其誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生冠癭堿的種類，分為 章魚堿型 、胭脂堿型 、 農(nóng)桿堿型 、 農(nóng)桿菌素堿型 (琥珀堿型 )。 TDNA的編碼基因 Vir區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能 30~40 kb，有 virA~virM等操縱子。 VirA蛋白 (92kD)是內(nèi)膜受體蛋白，感應(yīng)并結(jié)合酚類化合物 (乙酰丁香酮， AS)，是一種 自激酶并使 VirG蛋白 磷酸化而被激活。 VirG蛋白 (30kD)為轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)其他 vir基因的表達(dá)。 VirB蛋白構(gòu)成跨膜復(fù)合體 (T鏈復(fù)合體運(yùn)輸器 )供 TDNA越膜轉(zhuǎn)移。 VirC1蛋白與超驅(qū)動(dòng)序列 (離右邊界外側(cè) 17bp處的一個(gè) 24bp的保守序列 )結(jié)合，促進(jìn) TDNA加工。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白參與 TDNA加工形成 T鏈 ：首先 VirD1與25bp邊界序列親和結(jié)合，使其松弛，然后使 VirD2在特異位點(diǎn)剪切。 virE操縱子 ：誘導(dǎo)型， virE virE2基因。 virF操縱子 ：誘導(dǎo)型， virF基因。 virH操縱子 ：誘導(dǎo)型， virH virH2基因。 三、 TDNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的機(jī)理 (農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機(jī)理 ) ① 植物創(chuàng)傷反應(yīng)與農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的識別和附著； ②信號分子的釋放積累與 VirA蛋白的感應(yīng)； ③ VirG蛋白激活與 vir基因的誘導(dǎo)表達(dá)； ④ T鏈復(fù)合體的形成； T鏈 是指 vir基因被誘導(dǎo)表達(dá)后加工 TDNA而產(chǎn)生的單鏈 TDNA。 ⑤ T鏈復(fù)合體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)； 通過 T鏈復(fù)合體運(yùn)輸器 和 T菌毛 進(jìn)入植物細(xì)胞 。 四、 Ti質(zhì)粒的改造與轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建 野生型 Ti質(zhì)粒 不能直接作為 植物轉(zhuǎn)化載體 ： ① Ti質(zhì)粒分子過大，沒有單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，基因操作困難，不能直接將外源基因插入其 TDNA中； ② TDNA區(qū)的 onc基因產(chǎn)物將干擾受體植物內(nèi)源激素的平衡，導(dǎo)致冠癭瘤的產(chǎn)生，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生； 現(xiàn)已 通過中間載體途
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