【正文】 或多體形式結(jié)合到 Vir區(qū)啟動子的特定區(qū)域 ， 從而成為其它 Vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子 ， 打開 VirB、C、 D、 E、 H等幾個基因 。 它的 N未端部分具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu) 。 3. VirG操縱子的誘導(dǎo)表達及功能 VirG操縱子小于 VirA， 只有 ， 同樣是單基因結(jié)構(gòu) ， 只能編碼一條多肽 ， 被稱為 VirG蛋白 ， 即 DNA結(jié)合活化蛋白 （ DNAbinding activator protein） 。 VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶 （ autokinase） 的功能 ， 可在保守的組氨酸殘基上磷酸化 ， 從而 VirA蛋白被激活 。 Vir基因在接受植物細胞產(chǎn)生的創(chuàng)傷信號分子后才能轉(zhuǎn)錄活化 ， 其中首先是 VirA編碼一種結(jié)合在膜上的化學受體蛋白（ membrane bound chemoreceptor protein， 92kD） ， 可直接對植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng) ， 稱為感應(yīng)蛋白 （ sensor） 。 而 Nopaline有 7個操縱子 ,比 Octoppine少一個 VirF操縱子 。 Octopine Ti質(zhì)粒的 Vir區(qū)大小為40bp,含有 VirA、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H(舊稱PinF)等 8個操縱子 (operon),共 24個基因 。 Vir區(qū)僅位于 T區(qū) DNA左側(cè) 。 Tms和 Tmr基因是致瘤所必須的基因 ，因此又稱它們?yōu)橹铝龌?（ onc gene） 。 同時 Cyt基因突變將會阻斷細胞分裂素的大量合成 ， 兩者之間的比值下降到 ， 因此有利于根的形態(tài)發(fā)生 。 TDNA區(qū) 編碼基因的功能 Aux基因突變將阻斷腫瘤細胞生長素的大量合成 ， 使細胞內(nèi)的細胞分裂素與生長激素的比值升高 。 故稱為 Tmr（ tumour morphology root） 基因 ，即腫瘤形態(tài)根基因或 Roi（ root induction） 基因 ， 即根抑制基因 。 目前已查明 ，實際上 Aux基因包括兩個基因 ， 一個是 Auxl（ Tms1） ， 編碼色氨酸單加氧酶 （ typtophan monooxygenase） ， 將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚乙酰胺 （ indol acetamid， IAM） ， 故現(xiàn)在也稱為 Iam基因；另一個是 Aux2,編碼吲哚乙酰胺水解酶 ， 將 IAM轉(zhuǎn)變成乙酸吲哚 IAA，現(xiàn)稱為 iaaH基因 。 第二類是致瘤基因 ， 前兩個基因被稱作為生長素基因 （ Aux） ?；蛲蛔兒蟛荒苻D(zhuǎn)錄出它所編碼的 mRNA，這時可觀察到帶有突變基因的 TDNA的植物細胞的表型，從而確定這些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能。 ⑤ 植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性 。 ④ TDNA具典型的真核生物 RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號 ， 在其 5’端轉(zhuǎn)錄起始處有 TATA和 CAAT盒 。 ② TDNA上每個基因都有各自的啟動子 。 左邊界（ TL）缺失突變?nèi)阅苤铝?,但右邊界（ TR） 缺失則不再能致瘤 ,這里幾乎完全沒有 TDNA的轉(zhuǎn)移 ,這說明右邊界 (TR)在 TDNA轉(zhuǎn)移中的重要性。該 25bp邊界序列屬保守序列 ,但通常右邊界（ TR）序列更為保守，左邊界 (TL)序列在某些情況下有所變化。 l TDNA的兩端左右邊界各為 25bp的重復(fù)序列，即邊界序列（ border sequence），分別稱之為左邊界（ BL或 TL）和右邊界（ BR或 TR）。端都有真核表達信號 。 l Ti質(zhì)粒 TDNA區(qū)的長度約為 23kb l TDNA僅存在于植物腫瘤細胞的核 DNA中； TDNA含有激發(fā)和保持腫瘤狀態(tài)所必需的基因； TDNA和植物 DNA之間沒有同源 l 在 TDNA的 5180。 進一步研究證明 ， 這部分 DNA是從質(zhì)粒 DNA上切割后 ， 轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞 ， 故稱之為轉(zhuǎn)移 DNA（ transferredDNA） 。 以后這些作者將章魚堿型的 Ti質(zhì)粒 B6806用內(nèi)切酶 Sma I分解成 19個片段 ， 分別用同位素標記做成探針 ，然后與腫瘤 DNA進行分子雜交 ， 結(jié)果有二段 Ti質(zhì)粒的DNA（ 3b和 10c。 二、 TDNA的基因結(jié)構(gòu)與功能 Chilton等人 （ 1982） 利用同位素標記的 Ti質(zhì)粒做探針發(fā)現(xiàn) ， 加入高濃度煙草腫瘤細胞的 DNA后 ， Ti質(zhì)粒DNA的復(fù)性速度有加快的趨勢 。 ⑥ 決定寄主菌株的植物寄主范圍 。 ④ 賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細菌素的反應(yīng)性 。 ② 誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學特征和冠癭堿成分 。 （ 4） Ori區(qū) （ origin of replication） 該區(qū)段基因調(diào)控 Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。 （ 3） Con區(qū) （ regions encoding conjugations） 該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因 （ tra） ， 調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移 。 （ 2） Vir區(qū) （ virulence region） 該區(qū)段上的基因能激活 TDNA轉(zhuǎn)移 ， 使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性 ，故稱之為毒區(qū) 。 （ 1） TDNA區(qū) （ transferredDNA regions） ： TDNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時 ， 從 Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段 DNA， 稱為轉(zhuǎn)移 DNA。 第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 一 、 Ti質(zhì)粒的遺傳特性 、 結(jié)構(gòu)及功能 二 、 TDNA的基因結(jié)構(gòu)與功能 三、 Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 一、 Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能 1. Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型 l Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì) ， 為雙股共價閉合的環(huán)狀 DNA分子 ，其分子量為 95～ 156 106D, 約有 200kb組成 。 （ 5）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛毎妮d體，亦稱工程載體。 是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒 。 是由大腸桿菌質(zhì)粒插入 TDNA片段 、 目的基因和標記基因等構(gòu)建而成 。 與微生物基因工程相似 ， 通常是由多拷貝的 E. Coli小質(zhì)粒為載體 。 第一節(jié) 植物基因工程載體種類 根據(jù)其功能和構(gòu)建過程 ， 可分為以下種類 。第八章 植物基因工程載體及其構(gòu)建 第一節(jié) 植物基因工程載體種類 第二節(jié) 根癌農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 第三節(jié) Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機理 第四節(jié) Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建 第五節(jié) 常用選擇標記和報告基因 植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng) l （ Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、病毒轉(zhuǎn)化載體） l 2. DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、基因槍） l （花粉管通道法、生殖細胞浸泡法、胚囊子房注射法）。 載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、機理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng) , 其中又以 Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。 （ 1） 目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因 。 （ 2） 中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒 。 （ 3） 中間表達載體：是含有植物特異啟動子的中間載體 。 （ 4） 卸甲載體：是解除武裝的 Ti質(zhì)粒或 Ri質(zhì)粒 ， 是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒 。它是由中間表達載體和卸甲載體構(gòu)建而成。 l 根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同 ， Ti質(zhì)粒可以被分成四種類型：章魚堿型 (octopine)、 胭脂堿型(nopaline)、 農(nóng)桿堿型 （ agropine） 和農(nóng)桿菌素堿型 （ agrocinopine） 或稱琥珀堿型 (succinamopine) 2. Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域 Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€區(qū) 。 該 DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān) 。 TDNA區(qū)與 Vir區(qū)在質(zhì)粒 DNA上彼此相鄰 ， 約占Ti質(zhì)粒 DNA的三分之一 。 冠癭堿能激活 tra基因 ， 誘導(dǎo) Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移 ， 因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū) 。 3. Ti質(zhì)粒的生物學功能 Ti質(zhì)粒的功能可歸為以下 7個方面 : ① 參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸 （ IAA） 和一些細胞分裂素的活動 。 ③ 賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力 。 ⑤ 為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力 。 ⑦ 有的 Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長與發(fā)育 ， 即具有對噬菌體的 “ 排外性 ” 。 這表明腫瘤 DNA中有 Ti質(zhì)粒的順序 ， 但該順序不多 ， 而且沒有檢測到完整的 Ti質(zhì)粒 。 ） 能和腫瘤 DNA雜交 ， 也就是 Ti質(zhì)粒中這兩段 DNA是與腫瘤 DNA同源的部分 。 這是首次證明在高等植物的細胞內(nèi)存在有微生物的 DNA順序 。端和 3180。 如 TATAbox、AATAAbox及 polyA等 。 (圖 84)。其核心部分是 14bp，可分為 10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)兩部分 ,是完全保守的。 3. TDNA上的編碼基因及功能 TDNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點： ① TDNA的兩條鏈都是有意義鏈 ,即都能被轉(zhuǎn)錄 。 ③ 基因的轉(zhuǎn)錄由植物細胞 RNA聚合酶 Ⅱ