【正文】 ’?3’DNA聚合酶活性和 5’?3’外切酶活性 ；②無 3’?5’外切酶活性， 反應(yīng)五要素：參加 PCR 反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、 dNTP、模板和緩沖液（其中需要 Mg2+) ：變性（雙鏈 DNA 通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈 DNA ）、退火（ DNA 加熱變性 +引 物慢慢冷卻使其結(jié)合）、 延伸（適溫延伸 5’→ 3’引物形成新鏈變成 4 條鏈 DNA ） 基本原理：堿基互補(bǔ) 設(shè)計(jì)原則：（ 1）靠近 539。 DNA→ 瓊脂糖電泳→ 印跡轉(zhuǎn)移→ 預(yù)雜交→雜交（變性探針）→ 洗膜→放射自顯影或顯色 Northern Blot 原理： 在變性條件下將待檢的 RNA 樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot 相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。 二 分子雜交 義：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適當(dāng)?shù)臏囟?、離子強(qiáng)度等），按堿基互補(bǔ)的原則，重新形成雙鏈核酸分子的過程 2. 探針（ probe）：被標(biāo)記的核酸分子，可以是 DNA、 RNA 和合成的寡核苷酸 基本原理：堿基互補(bǔ)； 雜合雙鏈： DNA:RNA 、 DNA:DNA； 類型：液相雜交、固相雜交 ：凝膠電泳分離→變性→印跡轉(zhuǎn)移 → 預(yù)雜交 → 雜交→洗膜→雜交信號檢測 Southern Blot 原理： 將待檢測的 DNA 分子用 /不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝 膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的 DNA 或 RNA 探針進(jìn)行反應(yīng)。 加 5ml 甲醛（瓊脂糖終濃度為 1%）。 T7 噬菌體啟動子：具有高度特異性，只能由 T7 噬菌體的 RNA 聚合酶識別并啟動轉(zhuǎn)錄 T7 如何誘導(dǎo)調(diào)控的原理 ②轉(zhuǎn)錄終止子③轉(zhuǎn)譯起始序列④轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子⑤轉(zhuǎn)譯終止密碼子 第四章： 基因操作中大分子的分離和分析 一 核酸凝膠電泳（用于分離、鑒定和純化 DNA 或 RNA 片段；檢測：分子量、 DNA 濃度） ：核酸分子之糖 磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強(qiáng)度的電場中，它們會向正電極方向遷移（“ — ” →“ +”） 凝膠電泳： 核酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動速度有差異而分離 ① DNA 遷移率的影響因素： DNA 分子的大?。?反比 ） 、瓊脂糖濃度（反比）、 DNA 構(gòu)象、凝膠和電泳緩沖液中的 EB、電壓、瓊脂糖種類、電泳緩沖液 ②配制： 最常用 1%的，稱取瓊脂糖 1g，加 100ml 電泳緩沖液（ TAE），微波爐煮沸，冷卻到 50 度時倒膠 RNA 膠的制備： 瓊脂糖加 115ml 水，加熱融化。受 Lac 阻遏蛋白負(fù)調(diào)控，可用乳糖或類似物IPTG 的誘導(dǎo)，啟動能力比 Plac 和 Ptrp 都強(qiáng)； PL 啟動子：噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動子，受λ噬 菌體 CI 基因負(fù)調(diào)控。 ②重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能 維持正常的穩(wěn)定性。 2. 替換型載體（取代型載體）：具有成對的克隆位點(diǎn)，允許外源 DNA 片段替換非必需 DNA片段的載體。 冰醋酸 。1%SDS (現(xiàn)用現(xiàn)配 ) (主要作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性 . Solution II 要新鮮配置 ,NaOH 可吸收空氣中的二氧化碳而減弱堿性。加入 solutionⅠ后一定要充分打散菌體。 25mmol/L TrisCl()。 離 心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒 DNA。 流程 ： 取 毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀； 加入 100 微升冰冷的懸浮液，（ 50mM 葡萄糖， 25mM TrisHCl PH=, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）靜置 5 分鐘； 加入 200 微升微冷的裂解液（ ， %SDS）緩緩混勻置室溫 5 分鐘。而染色體 DNA不能復(fù)性而形成纏 連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 DNA 的分離和純化 從細(xì)菌中提取質(zhì)粒 DNA 的方法都包括以下三個步驟：培養(yǎng)細(xì)菌、收集和裂解細(xì)菌、純化質(zhì)粒 DNA 三種方法：氯化銫密度梯度離心法；堿變性法；煮沸法 原理：堿變性法抽提質(zhì)粒 是基于染色體 DNA 與質(zhì)粒 DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。若在該細(xì)胞中引入 pUC 質(zhì)粒，其上有 LacZ′，質(zhì)粒和大腸桿菌 DNA 可實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)， 表達(dá)出β 半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈藍(lán)色 （有活性、陰性克?。?。 （ 3）具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（ MCS multiple cloning sites ）； （ 4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 ： （ 1）具有復(fù)制起點(diǎn)；（ replication origin）自我增值的基本條件，一般具一個復(fù)制子。 （ 4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 。 （ 2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組 。 DNA 的轉(zhuǎn)移性：在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的 tra 基因產(chǎn)物。 是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 DNA 的復(fù)制類型：（拷貝數(shù)的多少） ： 嚴(yán)謹(jǐn)型、松弛型 質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 pMB1 1520 pUC pMB1 500700 pACYC P15A 10212 pSC101 pSC101 5 Co1E1 Co1E1 1520 ：在同一個大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時含有兩種同一復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒。 主要包括 ：大腸桿菌的啟動子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。 有適合的標(biāo)記，易于選擇。 三大特性：自我復(fù)制、克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記 （其他如易分離純化，具有啟動子） 能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 （克隆載體、表達(dá)載體） 來源：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、人工染色體載體、病毒載體 。 5’ → 3’合成 DNA，無 3’→ 5’外切活性 。 1 DNA 聚合酶Ⅰ活性：三種酶活性① 5’ → 3’ DNA 聚合酶活性② 5’ → 3’③ 3’→ 5’ 核酸外切酶活性 。 1 DNA 聚合酶： DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具備模板、引物、 dNTP等的情況下）及其相輔的活性。 ③提高外源片斷與載體的濃度的比值，（ 10～ 20 倍） 。粘性末端DNA 片斷之間的連接，酶濃度 個單位。 影響連接酶作用的因素 ①反應(yīng)溫度：連接 缺口的溫度： 37℃；連接粘性末端的最佳溫度： 4～ 15 ℃ 。 星星活性 ：在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱為星星活性（ star activity)。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。但有些同裂酶對甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。 同裂酶（ isoschizomers)： 指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。 三種（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶） 甲基化酶： 原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。 第二章：分子克隆工具酶 工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、 DNA 連接酶、 DNA 聚合酶、 DNA 修飾酶、核酸外切酶、單鏈核酸內(nèi)切酶 。 ① 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或 PCR 擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA 片段； ② 在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組 DNA 分子； ③ 將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（寄主細(xì)胞），并與之一起增殖 ； ④ 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了細(xì)胞重組 DNA 分子的受體細(xì)胞克??； ⑤從 篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用； ⑥ 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 基因工程期末復(fù)習(xí) 第一章：基因工程 1. 定義：通過基因操作來定向改變或修飾生物體或人類自身，并具有明確應(yīng)用目的的活動稱為基因工程。 2. 基因工程研究的主要內(nèi)容或步驟： 基因克隆的通用策略 ：涉及的過程可用 分 /合成、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒 。 ：載體、質(zhì)粒、片段 。 限制性內(nèi)切酶：是一類能夠識別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。 三種（） 回文結(jié)構(gòu)：雙鏈 DNA 中含有的二個結(jié)構(gòu)相同、方向 相反的序列稱為反向重復(fù)序列，每條單鏈以任一方向閱讀時都是一樣的。同裂酶可能進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。 同尾酶（ isocaudamer） ： 指來源不同、識別 靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。 影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：① DNA 濃度② DNA 的甲基化程度③酶切消化反應(yīng)的溫度（大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度 37 度）④ DNA 的分子結(jié)構(gòu) 。 Ｔ 4 連接酶： 該酶常從Ｔ 4 噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ 4 噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ 4 連接酶。 ② Ｔ 4DNA 連接酶 的用量：平末端 DNA 分子的連接反應(yīng)中，最適 1～ 2 個單位。 ATP 的用量 10μ mol~1mmol/L 之間 。 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法 。依賴于 DNA 的 DNA 聚合酶： DNA 聚合酶Ⅰ (全 酶 )； DNA 聚合酶Ⅰ大片段 (klenow 片段 )；耐熱 DNA 聚合酶 (Taq 酶 )；依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶：反轉(zhuǎn)錄酶。 1 逆轉(zhuǎn)錄酶：以單鏈 RNA 為模板合成雙鏈 DNA 的反應(yīng)。 第三章 分子克隆載體 載體：將外源 DNA 或基因攜帶入宿主細(xì)胞 (host cell)的工具。 二 .質(zhì)粒： 染色體外的遺傳因子，能自我復(fù)制，多數(shù)為雙鏈閉環(huán) DNA，大小 1KB200KB 外源 DNA 如超過 10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和 DNA 得率都非常低 。 要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites ， MCS）。 表達(dá)性質(zhì)粒載體 ：按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定 位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。 ： SC 型共價(jià)閉合環(huán)形 DNA（ ccc DNA）、 OC 型開環(huán) DNA（ ocDNA）、 L 型線性 DNA。也稱為質(zhì)粒的不相容性。 質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。 ： （ 1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于用作選擇 。 （ 3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量 。 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件；方法就是重組 。 （ 2）具有篩選標(biāo)簽；理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。 ：抗菌素抗性（氨芐青霉素抗性基因 ampr、四環(huán)素抗性基因 tetr、氯霉素抗性基因 Cmr、卡那霉素抗性基因 kanr 新霉素 neor 抗性基因） －互補(bǔ) ：① lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ) ② 宿主和載體各自編碼的α片段和ω片段雖然沒有酶活性，但是當(dāng)載體和宿主細(xì)胞同時表達(dá)時，產(chǎn)生的α片段和ω片段發(fā)生互補(bǔ)，可形成具有酶活性的 β 半乳糖苷酶，稱作α－互補(bǔ) 這個互補(bǔ)系統(tǒng)用來監(jiān)測質(zhì)粒上有無插入序列 ③藍(lán)白斑篩選 ： pUC 質(zhì)粒 在 LacZ— 的大腸桿菌中，在有 IPTG 誘導(dǎo)物和 Xgal 生色底物的平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。 如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個酶切點(diǎn)上克隆了外源基因，則 LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β 半乳糖苷酶，因此菌落呈白色 （無活性、陽性克隆） 。在 的高堿性條件下，染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 都發(fā)生變性，但質(zhì)粒超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，所以當(dāng)以 的 KAc 高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH 至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA 又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，保存在溶液中。通過離心，染色體 DNA 與不穩(wěn)定的大分子 RNA、蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。 加入 150 毫升冰冷的 PH= 的 3M 醋酸鈉，振蕩后，冰浴 5 分鐘。 溶液Ⅰ ： 50mmol/L 葡萄糖 。 10mmol/L EDTA(pH ) (主要作用： Solution I 中的 EDTA 可以螯合二價(jià)金屬離子進(jìn)而抑制依賴于二價(jià)金屬離子的 DNA 酶的活性，對 DNA 起到保護(hù)作用。 ) 溶液Ⅱ (pH ) ： 。加入 solution II 后放置時間不要超過 5min，以免變性質(zhì)粒不易復(fù)性 ) 溶液Ⅲ (pH ) ： 100ml5mol/L NaAc 60ml。 雙蒸水 (作用：中和堿液，質(zhì)粒 DNA 復(fù)性，變性蛋白－ SDS＋ , 線性 DNA 沉淀 ) 三 噬菌體載體 ：吸附、注入、合成、組裝、釋放 （特有多極調(diào)控 、 923KB） DNA 是一條線性雙鏈 DNA 分子，一