【正文】 bination)——整段 DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間 , 甚至不同物種間進(jìn)行交換 , 并能在新的位置上復(fù)制 , 轉(zhuǎn)錄和翻譯。 ? ，科學(xué)家公布人類基因組工作草圖 。 ? 1997， 英國(guó)羅斯林研究所，多莉羊 。 2. DNA 的擴(kuò)增 (Amplification ) 。 5. 目的基因的擴(kuò)增及獲得目的產(chǎn)物。 3. 將重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 。 基因工程的主要研究?jī)?nèi)容 : 1. 獲得具有遺傳信息的目的基因 。 克隆 (Clone) 從一個(gè)共同祖先無(wú)性繁殖下來(lái)的一群同一 DNA分子 , 細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體。 一、 基因工程的定義 第一章 基因工程概論 有關(guān)術(shù)語(yǔ)解釋： ? DNA嵌合體（ DNA chimera）： 內(nèi)、外源 DNA插入載體分子所形成的雜合分子（嵌合 DNA)。 二、從市場(chǎng)格局來(lái)看 據(jù)估算，我國(guó)生物制藥的總體產(chǎn)業(yè)規(guī)模僅為 80億元上下 (具體為血液制品 30億元、診斷試劑 5億元、生物基因藥物 15億元、生化制藥 30億元 )。 ? 同種產(chǎn)品生產(chǎn)廠家過(guò)多 ? 新藥研發(fā)創(chuàng)新的體制尚未形成 ? 醫(yī)藥市場(chǎng)混亂 我國(guó)研發(fā)和生產(chǎn)基因工程藥物都有較大的發(fā)展?jié)摿?，基因工程藥物的市?chǎng)需求量巨大，以重組人干擾素為例，其治療的主要適應(yīng)癥患者，目前我國(guó)乙肝病毒攜帶者超過(guò)，乙肝患者有 3000萬(wàn)人，丙肝患者有 1000萬(wàn)人，結(jié)核患者超過(guò) 450萬(wàn)人，另外，居民高血壓、糖尿病、惡性腫瘤和心腦血管疾病的發(fā)病率不斷增加，對(duì)新生物醫(yī)藥的需求非常迫切 。 ? 利用基因重組技術(shù)，修飾胰島素的氨基酸組合： 三、基因工程制藥的現(xiàn)狀與發(fā)展前景 ? 國(guó)外現(xiàn)狀 ? 上市藥類種類多，幅面廣； ? 研發(fā)機(jī)制成熟； ? 投資規(guī)模大，抗風(fēng)險(xiǎn)能力強(qiáng)； ? 利潤(rùn)大，投資回報(bào)率高。 牛胰島素晶體結(jié)構(gòu)模型 我國(guó)科學(xué)家與諾貝爾獎(jiǎng)擦肩而過(guò) ? Rosalyn Yalow (and Solomon Berson)（美國(guó)） ? 1959年開(kāi)始用 放射免疫方法測(cè)定血液中胰島素含量 1977年， 獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 1979年 Ullrich 和 Itakura —— 闡明了胰島素質(zhì)粒的分子序列 1979 1981年 Goeddel 和 Chance —— 開(kāi)始用 DNA技術(shù)生物合成人胰島素 1981年 –今 —— 基因合成重組人胰島素系列制劑 20世紀(jì)末，人胰島素類似物研制成功！ 5. 改造胰島素 ? 胰島素的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)對(duì)維持其生物活性有很重要的意義，人工合成的胰島素制劑受此影響在皮下注射后需有一定的解離時(shí)間才能發(fā)揮效力，故治療時(shí)需提前 2030分鐘注射胰島素。但對(duì)糖尿病病因的了解和治療上有實(shí)質(zhì)上的進(jìn)展還不到一百年。 ? 第一個(gè)批準(zhǔn)的我國(guó)生產(chǎn)的基因工程藥物 —— 重組人干擾素 ɑ1b(Rhu IFN ɑ1b),1989年開(kāi)始申報(bào)，1993年批準(zhǔn)試生產(chǎn)，也是唯一的獨(dú)創(chuàng)的一類新藥。討論結(jié)束時(shí)，他們決定建立一個(gè)公司，并取名為Genentech（ Geic Engineering Technology）。 人們從 450 L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長(zhǎng)激素，相當(dāng)于 6萬(wàn)具 尸體的全部產(chǎn)量 。以前，要獲得生長(zhǎng)激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長(zhǎng)激素。 基因工程制藥的重要性 治療 侏儒癥 的唯一方法，是向人體注射生長(zhǎng)激素。 基本步驟 ● 傳統(tǒng)制藥存在的問(wèn)題： A、材料來(lái)源困難或制造技術(shù)問(wèn)題而無(wú)法付諸應(yīng)用； B、從動(dòng)物臟器中提取出來(lái)，也因造價(jià)太高，或因來(lái) 源困難而供不應(yīng)求； C、由于免疫抗原等緣故，使它們?cè)谑褂蒙鲜艿较拗啤? ?確定對(duì)某種疾病有預(yù)防和治療作用的 蛋白質(zhì) ； ?獲得該蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的 基因 ； ?將該基因放入可以大量生產(chǎn)的 受體細(xì)胞 中（細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞）； ?利用受體細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)這些 蛋白質(zhì) ，即 基因疫苗或藥物 。偽狂犬病毒、單純孢疹病毒（ HSV）等。 以往治療血友病用凝血因子是從血液中提取的 , 血友病人有遭受病毒等病毒感染的危險(xiǎn)、用重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)凝血因子將克服血源性產(chǎn)品的缺點(diǎn)。 重組人生長(zhǎng)激素 重組人白細(xì)胞介素 重組人干擾素 重組人胰島素 一、基因工程藥物及其重要性 定義 種 類 ： a) 激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物 b) 細(xì)胞因子類藥物 c) 酶類藥物與凝血因子 d) 基因工程疫苗 a)激素類及神 經(jīng)遞質(zhì)類藥物 人生長(zhǎng)激素 釋放抑制因子 人胰島素 人生長(zhǎng)激素 c) 酶類藥物與凝血因子 ? 酶類藥物 有些酶類對(duì)人體疾病有特異性治療價(jià)值 , 其中最被重視的是能預(yù)防和治療急性心肌梗死等 血栓性疾病 的 鏈激（ SK） , 尿激酶 (UK),及 組織纖溶酶原激活劑 (tPA)。 什么是基因工程？ 基因工程（ geic engineering）： 又稱基因拼接技術(shù)和 DNA重組技術(shù)， 是以分子遺傳學(xué)為 理論基礎(chǔ) ，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的 現(xiàn)代方法為手段 ，將不同來(lái)源的基因按 預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖 ，在 體外構(gòu)建 雜種 DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞 ，以改變生物原有的遺傳特性、 獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品 。 （ 5）電泳上樣緩沖液的作用有哪些？ （ 6）如何估算引物的 Tm值？ （ 7）基因文庫(kù)的特點(diǎn)是什么？ （ 8）藥物蛋白分離純化的技術(shù)要求有哪些？ （ 9）包涵體及其形成的原因是什么？ 名詞解釋 雜交； 探針； 粘粒； 同尾酶（同裂酶） 。簡(jiǎn) 答 題 （ 1）如何克隆微生物的纖溶酶基因？ （ 2）獲得目的基因的途徑有哪些？ （ 3）限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)（掌握如何從給出的序列中尋找酶切位點(diǎn)）。 （ 4） PCR的類型及其應(yīng)用（舉例介紹）。 cDNA文庫(kù)； 基因工程藥物； 鹽析； 星活性 。 教 學(xué) 內(nèi) 容 I 基因工程制藥概論 (2學(xué)時(shí)） II 基因工程制藥原理及技術(shù) （ 25學(xué)時(shí)） 1) 基因工程概論（ 2學(xué)時(shí)） 2) 基因工程的基本技術(shù)（ 6學(xué)時(shí)） 3) 基因工程的工具酶和載體（ 6學(xué)時(shí)） 4) 目的基因的獲取方法（ 4學(xué)時(shí)） 5) 目的基因的表達(dá)系統(tǒng)（ 3學(xué)時(shí)） 6) 基因工程菌株的發(fā)酵（ 2學(xué)時(shí)） 7) 藥物蛋白的分離純化與質(zhì)量控制（ 2學(xué)時(shí)） III 基因工程藥物實(shí)例介紹 （ 3學(xué)時(shí)） IV 練習(xí)與復(fù)習(xí) （ 2學(xué)時(shí)） 基因工程藥物 （ Geic engineering drugs） 指利用 基因工程技術(shù) 研制和生產(chǎn)的藥物，主要包括 重組蛋白 (多肽 )藥物、反義核酸藥物、 DNA藥物和基因工程抗體 等。 ? 凝血因子 甲型血友病是缺乏 Ⅷ 因子 所致 , 乙型血友病是缺乏 Ⅸ 因子 所致 , 在血友病發(fā)病率中甲型占 80%。 d) 基因工程疫苗 ? 基因缺失活疫苗（減法疫苗） 目前這類疫苗中研究最多的是病毒疫苗，如流感病毒。 ? 基因工程活載體疫苗（加法疫苗） 通過(guò)表達(dá)外源保護(hù)性抗原基因，提供免疫保護(hù)。 基因工程藥物制備的基本過(guò)程 1. 目的基因的克隆； 2. 構(gòu)建 DNA重組體； 3. 構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）； 4. 目的基因表達(dá)； 5. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離分析； 6. 除菌、過(guò)濾； 7. 半成品 /成品檢定； 8. 包裝。 ● 基因工程技術(shù)的特點(diǎn)： 能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。而生長(zhǎng)激素的獲得很困難。 現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長(zhǎng)激素。 ? 基因工程藥品 —— 生長(zhǎng)激素 二、基因工程藥物發(fā)展歷程 ?DNA重組技術(shù)誕生 ——1972 ?世界第一個(gè)基因工程藥物的誕生：美國(guó) Lilly公司的 重組胰島素 投放市場(chǎng) ——1982 ?1996年，美國(guó)已擁有 1300多家 專門從事生物技術(shù)產(chǎn)品研究開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的公司， 70%從事生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)； 國(guó)外歷程 Genentech 公司 1976年， 27歲的風(fēng)險(xiǎn)投資人 Robert Swanson與University of California的教授 Herb Boyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。 第一個(gè)基因工程公司在學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！ Genentech的驕人業(yè)績(jī) 1976 Genentech創(chuàng)立 1977 首次在微生物里生產(chǎn)了人蛋白生長(zhǎng)激素抑制素 1978 克隆了人胰島素基因 1979 克隆了人生長(zhǎng)激素素基因 1980 公司上市，募集 $ 35 million 1982 第一個(gè)基因重組藥（人胰島素）上市（轉(zhuǎn)讓給 Lilly公司） 1984 第一個(gè) VIII因子，轉(zhuǎn)讓給 Cutter Biological 1985 第一個(gè)自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長(zhǎng)激素） 1987 生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（ tPA） 1990 生產(chǎn) interferon ?1? 2022 瑞 士 Roche醫(yī)藥公司并購(gòu) 2. 我國(guó)基因工程藥物的發(fā)展歷程 ? 20世紀(jì) 70年代初 開(kāi)始將 DNA重組技術(shù)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)上。 基因工程藥物研發(fā)事例 — 以胰島素為例 ? 糖尿?。? 糖尿病是個(gè)歷史悠久的慢性代謝性疾病，有文字記載的歷史已有上千年。 胰島素的研發(fā)史 自 18世紀(jì)至今，在諸多研究者不斷進(jìn)取的努力下，胰島素的研究經(jīng)歷了五個(gè)階段： ? 發(fā)現(xiàn)胰島素 ? 得到胰島素 ? 了解胰島素 ? 合成胰島素 ? 改造胰島素 1788年 Thomas Canley (英 ) — 證實(shí)胰腺損傷可導(dǎo)致糖尿病 1869年 Langerhans (德 ) — 發(fā)現(xiàn)胰腺內(nèi)具有分泌功能的細(xì)胞團(tuán) 18891893年 Von mering 和 Minkowski (德 ) — 證實(shí)胰腺細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生降血糖物質(zhì) 1893年 Edouard Laguesse (法 ) — 將胰腺細(xì)胞團(tuán)命名為胰島 1909年 Jean de Meyer (比利時(shí) ) — 將胰島分泌的降糖物質(zhì)命名為胰島素 1. 發(fā)現(xiàn)胰島素 1921年 —— 從狗的胰臟提取了胰島素并用于臨床 James B Collip (化學(xué)家 ) Frederick G. Banting (醫(yī)生 ) 獲 1923年 諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) Charies H Best (學(xué)生助理 ) Macleod (生理學(xué)家 ) 獲 1923年 諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng) 為紀(jì)念四位科學(xué)家為糖尿病治療做出的杰出貢獻(xiàn) 將班?。?Banting）醫(yī)生的生日（ 11月 14日）定為世界糖尿病日 3. 了解胰島素 1955年 —— Frederick Sanger (英國(guó) ) —— 闡明牛胰島素的氨基酸排列順序 獲得 1958年 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1965年 王應(yīng)睞，鄒承魯，龔岳亭等 (中 ) Katsoyannis PG (美 ) Meienhorer (德 ) —— 人工合成牛胰島素 1967年 Donald F. Steiner (美 ) —— 發(fā)現(xiàn)胰島素原 1969年 Dorothy Hodgkin (英 ) —— 確定胰島素氨基酸排列的三維空間結(jié)構(gòu) 1971年 Pierre Freychet (美 ) —— 確認(rèn)胰島素受體 1958年，由 中科院上海生物化學(xué)所 、 有機(jī)化學(xué)所 和 北京大學(xué) 聯(lián)合進(jìn)行人工合成胰島素研究，1965年獲得人工合成牛胰島素。 ? 糖尿病人需要更接近生理狀態(tài)、使用方便的胰島素制劑。 ? 國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀 ? 藥品生產(chǎn)多以仿制為主 , 自主開(kāi)發(fā)產(chǎn)品少 1989 年 ,我國(guó)科學(xué)家成功研制出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程一類新藥 α 1b 干擾素 ,成為我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的第一個(gè)基因工程藥物 ,也是到目前為止 惟一一個(gè)由我國(guó)自