【正文】 下，合成單鏈 RNA作為 雜交探針。常 用于 cDNA第一、二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR）。 端標(biāo)記或形成 DNA共聚尾巴。末端轉(zhuǎn)移酶 催化 NTP中的 NMP通過(guò)其磷酸基與 DNA 3’ OH連接而使 DNA鏈 延長(zhǎng)， 無(wú)需模板 。Taq DNA聚合酶 以 DNA為模板，催化 5’ →3’ 核酸鏈的延長(zhǎng)，另有 弱的 5’ →3’ 的外切 酶 活性，耐高溫。 名稱 功能及應(yīng)用 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 以 DNA為模板，催化 5’ →3’ 核酸鏈的延長(zhǎng)，另有 3’ →5’ 的外切酶 大片段 （ klenow） 活性。2. DNA連接酶3. 聚合酶 重組 DNA技術(shù)中，聚合酶（ polymerase）的最重要作用是以 DNA或 RNA為模板在體外合成 DNA或 RNA。 羥基 末端之間形成 磷酸二酯鍵 ，使 DNA切口封合或使兩個(gè) DNA分子或片段連接。 連接酶可催化 DNA分子中相鄰 539。 表 152一些常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生相同類型的粘性末端，稱為 同尾酶 ，所產(chǎn)生的末端稱配伍末端（ patible end） ，可進(jìn)行相互連接。 339。339。 Pst I 539。如 Pst I：539。 端 切割產(chǎn)生 339。 …CTTAA G… 539。 …C TTAA ▲ G…539。 …G AATTC…339。 …G ▼ AATT C…339。從 5’ 端 切割產(chǎn)生 539。 …CAA TTG… 539。 …CAA ▲ TTG…539。 …GTT AAC…339。 …GTT ▼ AAC…339。 …C TTAAG…539。 …GAATT C…339?；匚慕Y(jié)構(gòu) II類限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別 DNA 位點(diǎn)的核苷酸序列呈 二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 ，通常稱這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)?回文結(jié)構(gòu) 。 端為羥基 。 II型酶作用特點(diǎn)是有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以內(nèi)切方式水解雙鏈 DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的 DNA片段 539。限制性內(nèi)切酶的分類和特點(diǎn) 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割 DNA方式不同，可分為 I、 II、 III型。第一個(gè)大寫字母 取自 細(xì)菌屬名 的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)小寫字母 取自微生物 種名 的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母 代表該微生物同種內(nèi)不同的 株系 ；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用 羅馬數(shù)字 表示。限制酶的命名 限制酶的命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。 限制性內(nèi)切酶和甲基化酶 共同構(gòu)成細(xì)菌的 限制和修飾 系統(tǒng)。（二）重組 DNA中的工具酶? 限制性核酸內(nèi)切酶? 連接酶? 聚合酶? 多聚核苷酸激酶? 堿性磷酸酶1. 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease）定義： 能識(shí)別 DNA的 特異序列 ，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍 切割雙鏈 DNA的一類核酸內(nèi)切酶。? 轉(zhuǎn) 入細(xì)菌。? 用合適的酶 切 割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。從篩選出的陽(yáng)性克隆 中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。? 將重組 DNA分子 轉(zhuǎn) 移到適當(dāng)?shù)?受體細(xì)胞 （亦稱宿主細(xì)胞）， 并與之一起增殖。1997年 2月 23日英國(guó) Wilmut? 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中， 分 離出 目的基因 片段。一、重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念（一） DNA克隆 由于 DNA克隆 研究對(duì)象常常是特異的基因片段，所以又稱作 基因克隆（ gene cloning） 。在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì) —— 同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與 載體 DNA結(jié)合成一 具有自我復(fù)制能力 的 DNA分子（復(fù)制子），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得該 DNA分子的大量拷貝?；蛑亟M與基因工程生物工程定義 生物工程是 生物技術(shù) 的總稱，是對(duì)生命有機(jī)體在 分子 水平、 細(xì)胞 水平、 組織 水平、 個(gè)體 水平進(jìn)行不同層次的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類的現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)學(xué)科。生物技術(shù)的四大體系? 基因工程? 細(xì)胞工程? 酶工程? 發(fā)酵工程 重組 DNA技術(shù)（ rebinant DNA technique） ，又叫DNA克隆 （ DNA cloning） 。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱 分子克?。?molecular cloning） 。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為 基因工程（ geic engineering） 。? 用合適的酶 切 割 目的基因和載體 ，產(chǎn)生匹配的末端? 在體外，將目的基因片段連 接 到能自我復(fù)制的并且具有 選擇標(biāo)記的載體分子上，形成 重組 DNA分子 。? 篩 選出獲得了重組 DNA分子的受體細(xì)胞克隆?；蚩寺〉幕静襟E基因克隆的基本步驟粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段接 (連接 )連接后的重組質(zhì)粒 DNA分子重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn) (轉(zhuǎn)化 ) 染色體真好玩 !篩 (篩選 )分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著 !玩完啦 !大腸桿菌大腸桿菌大量生長(zhǎng)提取大量 質(zhì)粒酶 切 鑒定您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！? 分 離目的基因和載體DNA。? 連 接 酶將目的基因裝入載體。? 篩 選具有抗藥性克隆。 主要來(lái)源于原核生物，可將侵入宿主細(xì)胞的外源性 DNA迅速降解，而對(duì)細(xì)菌自身的 DNA，則通過(guò)甲基化酶在該限制酶切位點(diǎn)