【正文】 tar活性，降低特異性。 ? DNA：經(jīng)過(guò)純化的，盡量不含有蛋白質(zhì)，酒精等雜質(zhì)。形成粘性末端 (cohesive end)者較有利于載體 DNA和目的基因的重組。突出粘性末端和 539。 ? 限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 400多種，所識(shí)別的順序往往為 48個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)。 ? 經(jīng)改造后具有 多克隆位點(diǎn)。 ? 具有 自我復(fù)制 功能。 ? 合適的復(fù)制位點(diǎn) ,為目的基因提供在受體細(xì)胞中的 復(fù)制能力或整合能力 。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。 C文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。 ? 用途： PCR引物 ,測(cè)序引物 ,定點(diǎn)突變 ,核酸雜交探針 從基因文庫(kù)中篩選 ? 將某一種基因 DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體 DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組 DNA的種群，稱為 G文庫(kù) (genomic DNA library)。較短的核酸片段（ 6080bp） 多肽鏈的氨基酸順序 mRNA的堿基排列順序 相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu) 化學(xué)合成目的基因 ? 化學(xué)合成的最大優(yōu)點(diǎn)是可以合成一些分離較困難的基因。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 目的基因 基因載體 重組體 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 表 總體技術(shù)路線 (分 )目的基因及載體的分離 需要克隆的 DNA片段： 化學(xué)合成法 cDNA文庫(kù) 基因組 DNA文庫(kù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 目的基因的獲取 ? 從基因所在生物直接取得 用限制酶剪切供體 DNA 用機(jī)械的方法 eg 超聲波 化學(xué)合成法 人工合成： ? 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。 1977年，吉爾伯特（ W 科恩隨后以 DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國(guó)專利局申報(bào)了世界上第一個(gè)基因工程的技術(shù)專利。 博耶 將兩個(gè)不同的質(zhì)粒（一個(gè)是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個(gè)是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。 科恩 和加州大學(xué)舊金山分校教授 H伯格因此獲得了 1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 。 現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人 P重組 DNA技術(shù) 基因重組與基因工程 基因工程亦稱遺傳工程，即利用 DNA重組技術(shù)的方法，把 DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源 DNA（目的基因）和載體 DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入 宿主 細(xì)胞，使外源基因 DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（ cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。 基因重組技術(shù)作為分子生物學(xué)最重要、最基本的技術(shù)之一，是許多分子生物 ,生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)施的基礎(chǔ)。 伯格 （美國(guó) ,1926－）在 1960年以敏銳的科學(xué)預(yù)見力提出一個(gè)大膽的設(shè)想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動(dòng)物體內(nèi)，以達(dá)到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？ 1972年，伯格把兩種病毒的 DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用 DNA連接酶把這兩種 DNA分子連接起來(lái)，于是產(chǎn)生了一種新的重組 DNA分子，首次實(shí)現(xiàn)兩種不同生物的 DNA體外連接，獲得了第一批重組 DNA分子，這標(biāo)志著基因工程 技術(shù)的誕生。 1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)教授 SW這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細(xì)胞分裂時(shí)也能自我復(fù)制。這標(biāo)志著自然界不同物種間在億萬(wàn)年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。Gilbert ）分別將編碼胰島素和干擾素的 DNA經(jīng)過(guò)體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。 ? 化學(xué)合成的不足之處在于： 要已知基因的核苷酸順序； 基因不能太大，這一方面是測(cè)定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因?yàn)槊看蝺H能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低； 價(jià)格昂貴。 ? 將某種細(xì)胞的全部 mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)合成 cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為 C文庫(kù) (cDNA library)。 從 mRNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ? 構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題 —— 費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列 ? 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢(shì) —— 獲取的 DNA片段往往是 具有特定功能的目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ polymerase chain reaction,PCR） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在體外合成目的基因。 載體 DNA的選擇 理想載體的基本條件： ? 可轉(zhuǎn)移性 ,為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移 能力。 ? 多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異 ? 選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定 ? 分子較小，可容納較大的外源 DNA ? 質(zhì)粒 ? 噬菌體 ? 腺病毒載體 ? 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 ? …… 種類： 質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu) ? 存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。 ? 帶有抗性基因及表型識(shí)別等 遺傳性標(biāo)記物 。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 切 限制性內(nèi)切酶酶切 限制性內(nèi)切酶酶切 酶切 載體和目的基因的切斷 ? 通常采用限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease)，簡(jiǎn)稱限制酶，分別對(duì)載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。 ? 由限制酶切斷后的末端可形成平端、 339。突出粘性末端三種情況。 酶切 雙酶切： ? 體系 ：選擇合適的緩沖體系，尤其是雙酶切反應(yīng)中。 ? 時(shí)間 ：一般為 57h，載體 overnight以保證酶切完全。 ? 酶切之后立即回收，小片段用 PCRpurification Kit 除去， 大的片段要用切膠回收去除。如將載體與目的基因