【正文】 人們正期待基因工程技術(shù)在農(nóng)藥殘留的微生物降解中發(fā)揮重要作用。此外，還實(shí)現(xiàn)了甲基對(duì)硫磷水 解酶基因在芽孢桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)量提高了 20多倍，獲得既有農(nóng)藥降解能力又有生防功能的工程菌株。 （五）農(nóng)藥殘留的微生物降解技術(shù) 農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù)就是針對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等化學(xué)農(nóng)藥的大量施用造成農(nóng)產(chǎn)品以及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)、農(nóng)產(chǎn)品市場競爭力下 降等嚴(yán)重情況，克服物理、化學(xué)處理修復(fù)難度大、成本高，并且還會(huì)有二次污染的缺點(diǎn)，從生物技術(shù)的角度，利用微生物種類繁多、代謝類型極為豐富的特點(diǎn)，通過篩選高效農(nóng)藥殘留降解菌株，克隆降解基因并重組多種降解基因于某些宿主菌中，在可控條件下高效表達(dá)降解活性，利用微生物所產(chǎn)生的酶類應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的原位生物修復(fù)，達(dá)到徹底清除土壤、水體、農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)污染物的目的。 微生物在脫硫的同時(shí)，不降低柴油的熱值和汽油的辛烷值，因此可用于石油污染的生物整治。其次，含硫化合物的存在加重了石油精煉設(shè)備如貯存罐、運(yùn)輸管線等的腐蝕，增加了精煉成本。 （四）石油產(chǎn)品的微生物脫硫技術(shù) 汽油和柴油等石油產(chǎn)品的加工過程會(huì)使產(chǎn)品中硫含量提高，它們?nèi)紵a(chǎn)生的一氧化碳、氮氧化物（ NOx）、二氧化硫、碳?xì)浠衔锛翱晌腩w粒物等嚴(yán)重污染了空氣。采用生物漂白技術(shù)替代化學(xué)漂白法是今后造紙工業(yè)實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)的一個(gè)最重要發(fā)展方 向。用傳統(tǒng)化學(xué)漂白法去除紙漿中殘留的木質(zhì)素通常會(huì)產(chǎn)生大量有毒的、強(qiáng)烈致癌致畸的含氯廢水。 （三） 造紙工業(yè)中木聚糖酶高效表達(dá)工程菌的應(yīng)用 造紙工業(yè)是世界上六大污染工業(yè)之一，造紙廢水包 括化學(xué)制漿和化學(xué)漂白兩部分。芳烴及其衍生物降解基因通常連鎖成簇組成操縱子，如兒茶酚降解 基因 catABCD、氯代聯(lián)苯降解基因 bphABCD、 2,4D降解基因 tfdCDEF、氯代苯甲酸降解基因 xylABC和 xylDFEFG等。通過基因工程的手段增強(qiáng)或增添菌株的污染物降解能力，能使其在工業(yè)、城市廢物或多種污染物混合環(huán)境中高效發(fā)揮生物解毒或降解功效。但是 許多微生物在實(shí)驗(yàn)室條件下能高效降解污染物，而在自然條件下卻不能很好地發(fā)揮作用。自然界存在很多能降解芳烴及其氯代衍生物的土著微生物，在污染物生物解毒、降解和礦化過程中起主導(dǎo)作用。 圖 1613 重組 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌（ R. eutropha） MTβ對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù) （ Valls等， 2020） A，（ 1） 15天煙草苗生長在滅菌對(duì)照土壤中；（ 2）土壤中接種富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 (R. eutropha) CH34 108個(gè) /g土；（ 3）土壤中接種重組富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 (R. eutropha) MTβ108個(gè) /g土； B，土壤含鎘（ Cd2+） 150? ol/Kg土，（ 1）、（ 2）和（ 3）的處理同 A。 Valls等（ 2020） 以 淋病奈瑟球菌 （ Neisseria gonorroheae） 中 IgA蛋白 βdomain編碼區(qū)與小鼠 MT基因編碼區(qū)融合，構(gòu) 建的重組蛋白通過轉(zhuǎn)座子載體 TnMTβ1導(dǎo)入 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 CH34中，得到的基因工程菌MTβ能夠有效固定鎘離子，明顯降低了鎘離子對(duì)煙草生長的毒性（圖 1612，圖 1613）。小鼠 MT基因已被克隆，而且在分子水平上其固定重金屬的機(jī)理已經(jīng)清楚，它的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合7個(gè)二價(jià)金屬離子。目前已有研究者利用細(xì)菌表達(dá)金屬硫蛋白 MT（ metallothionein） 提高其固定污染土壤中游離重金屬離子的能力。相比之下，微生物的生物富集不僅成本低，而且效率更高。如何降低和消除這些重金屬離子對(duì)環(huán)境造成的危害至今仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。引起土壤污染的物質(zhì)種類繁多，其主要來源是各種廢棄物 (如工業(yè)廢渣廢水、生活污水、汽車尾氣等 )，以 及不合理施用農(nóng)藥、化肥及污水灌溉等。 （一）修復(fù)重金屬離子污染土壤的基因工程菌 人類活動(dòng)會(huì)向土壤中添加各種有害物質(zhì)，造成土壤污染。近年來，隨著基因組和生物芯片技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展與滲透，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)在解決復(fù)雜的環(huán)境污染問題上顯示出獨(dú)特的能力。 四、 環(huán)境微生物基因工程菌的應(yīng)用 環(huán)境微生物基因工程技術(shù)是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢物資源化的首選，它能將有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化為沼氣、酒精、有機(jī)材料或原料、單細(xì)胞蛋白等。通過基因重組，將來自真菌茄病 鐮刀菌 (Fusarium solani)的 D氨基酸氧化酶基因和來自缺陷短波 假單胞菌 (Pseudomonas diminuta)的頭孢菌素?；富蜣D(zhuǎn)化能產(chǎn)生頭孢菌素 C 的 產(chǎn)黃頭孢（ Acremonium chrysogenum） ，得到的基因工程菌 就能大量合成 7ACA (圖 1611)，展現(xiàn)出用于 工業(yè)生產(chǎn)的潛力。可見在缺氧微生物細(xì)胞中表達(dá)透明顫菌屬血紅蛋白可以使細(xì)胞獲得足夠的氧氣進(jìn)行增殖?？茖W(xué)家借鑒好氧微生物用來抵御缺氧環(huán)境的策略，如好氧菌 透明顫菌屬 (Vitreoscilla)能 合成同源二聚體血紅素蛋白，將該基因克隆入鏈霉菌質(zhì)粒載體，在天藍(lán)色鏈霉菌中利用透明顫菌屬血紅蛋白基因的啟動(dòng)子表達(dá)。 （ 1）開發(fā)能有效利用氧氣的鏈霉菌 利用鏈霉菌進(jìn)行大規(guī)?？股厣a(chǎn)時(shí)常常遇到的問題 355 是缺氧。 目前 雖沒有出現(xiàn)有價(jià)值的化合物 ,但終于露出了 一線 曙光 !如果將生物合成與化學(xué)轉(zhuǎn)化相 結(jié)合 ,在今后幾年內(nèi) 很快就 會(huì)出現(xiàn)驚人的應(yīng)用前景。 隨著 鏈霉菌 基因組測序的不斷開展 ,人們對(duì)抗生素的生物合成途徑的了解也不斷深入。但用 pIJ2303 轉(zhuǎn)化紫紅鏈霉菌 Tu22，將同時(shí)合成放線菌紫素和一種新的抗生素 二氫榴菌紫素 。該抗生素屬于 異苯并二 氫砒喃醌類 (isochromanequinones)抗生素家族。已知某鏈霉菌能合成 梅德 霉 素 (Medermycin)， 天藍(lán)色鏈霉菌（ S. coelicolor） 能合成 放線菌紫素 (actinorhodin)。重組 DNA 技術(shù)的應(yīng) 用，使人們可以用來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上獨(dú)一無二、活性上升而副作用減小的新抗生素；其次，通過遺傳操作也能夠迅速提高產(chǎn)量從而降低生產(chǎn)成本?？股卦诩?xì)菌疾病治療中的廣泛使用不僅使人類的健康水平有了巨大的提高，也挽救了無數(shù)的生命。 354 對(duì)于其它限制性內(nèi)切酶以及其它分子克隆工具酶也可以用類似的方法超量表達(dá)從而大規(guī)模生產(chǎn)。最后發(fā)現(xiàn)在得到的 4kb 克隆片段中含有完整的 PstI 限制性內(nèi)切酶和甲基化酶基因的操縱子。例如限制性內(nèi)切酶 PstI 基因是從革蘭氏陰性細(xì)菌 斯氏普威登斯菌 (Providencia stuartii)中分離出來的。 限制性內(nèi)切酶的商品化生產(chǎn)是將限制性內(nèi)切酶基因克隆到大腸桿菌內(nèi)，在人為條件下過量表達(dá)目的限制性內(nèi)切酶。 （四）限制性內(nèi)切酶的生產(chǎn) 限制性內(nèi)切酶天然存在于多種微生物中，是限制和修飾系統(tǒng)中的重要成分，是分子克隆和核酸分析研究的常用工具。途徑 A 中的萘雙加氧酶由 NAH7 質(zhì)粒編碼； 途徑 B 中的二甲苯氧化酶由質(zhì)粒 TOL 編碼。因此可以利用重組大腸桿菌，將其 細(xì)胞通過物理或化學(xué)方法固定在固體基質(zhì)上，制備 合成靛藍(lán)的 生物反 應(yīng)器 (Bioreactor)，大量生產(chǎn)靛藍(lán)，高效、安全又經(jīng)濟(jì)，避免了化學(xué)方法合成時(shí)不得不接觸的一些危險(xiǎn)化合物如苯胺、甲醛、氰化物等?？梢娡ㄟ^遺傳操作將不同的兩種代謝途徑和微生物組合在一起能意外地合成靛藍(lán)。假單胞菌是能夠利用萘、甲 苯、二甲苯、酚等復(fù)雜有機(jī)物作為唯一碳源、在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值的微生物類群，它們通常具有約 50200kb 的降解質(zhì)粒 。 (三 ) 合成 靛藍(lán)的工程菌 靛藍(lán)可用于印染棉布和羊毛制品，特別是用來印染藍(lán)色牛仔服裝。 酶是食品加工中的重要輔助劑，利用基因工程菌生產(chǎn)酶有許多優(yōu)點(diǎn)，例如：產(chǎn)量高、質(zhì)量均一、穩(wěn)定性佳、價(jià)格低廉等，因此具有很好的發(fā)展前景。 （ 4） 其它酶制劑 采用基因工程手段生產(chǎn)工業(yè)用的酶種類很多 ， 如 超氧化物歧化酶 (SOD)，生產(chǎn)高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶等，都獲得了比原始菌高出數(shù)倍酶產(chǎn)率的基因工程菌株。但由于 β環(huán)狀糊精葡基轉(zhuǎn)移酶 (βcyclodextrin glucosyltransferase， βCGT)生產(chǎn)菌產(chǎn)酶活力低，導(dǎo)致 β環(huán)狀糊精因生產(chǎn)成本高，應(yīng)用受 到限制。將一 352 種 梭狀芽孢桿菌 (C. thermosufurogenes)的 β淀粉酶基因轉(zhuǎn)到 短短芽孢桿菌 (Brevibacillus brevis)中 ， 獲得的工程菌培養(yǎng)溫度是 37℃， 產(chǎn)酶能力在六天內(nèi)持續(xù)增長 ， 然后穩(wěn)定在最高產(chǎn)酶水平，此工程菌 可望用于耐熱 β淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)。 （ 2）耐熱 α淀粉酶和 β淀粉酶 1979年，日本科學(xué)家將高產(chǎn) α淀粉酶基因轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿菌中，得到 的轉(zhuǎn)化 株酶活 力比野 生型原 始菌株 高五 百倍。 1990年美國 FDA已批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因凝乳酶在干酪生產(chǎn)中使用。凝乳酶的另一生產(chǎn)途徑是直接從微生物中萃取，但它在使用中常常會(huì)引起奶酪的苦味，使其在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。凝乳酶是生產(chǎn)奶酪的必需用酶，最早是從小牛第四胃的胃膜中萃取出來的一種凝乳物質(zhì)。 （ 1）凝乳酶 凝乳酶 (chymosin)是第一個(gè)應(yīng)用于食品工業(yè)的基因工程酶。目前已有一百多種酶基因?qū)肓斯こ叹?，包括尿激酶基因和凝乳酶基因等。目前酶制劑生產(chǎn)發(fā)展的主要方向是將生物技術(shù)應(yīng)用于酶工程領(lǐng)域，生物酶工程主要包括三方面的內(nèi)容： ① 利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶； ② 對(duì)酶基因進(jìn)行遺傳修飾； ③ 設(shè)計(jì)出新的酶基因。重組草生歐文菌可以直接將 D葡萄糖轉(zhuǎn)化成 2,5DKG，而克隆的 2,5DKG 還原酶又能將其轉(zhuǎn)變成 L抗壞血酸的前體 2KLG(圖 169)。 目 前抗壞血酸合成是通過適宜的微生物共發(fā)酵，從而利用葡萄糖生成 2KLG。許多微生物可以通過不同途徑合成 2KLG。為提高成功率，在絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷和 L半胱氨酸非利用型的大腸桿菌中表達(dá)來自植物擬南芥中分離出不受反饋抑制影響的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，能產(chǎn)生更高水平的 L半胱氨酸。許多微生物都可以合成 L半胱氨酸，但由于 L半胱氨酸會(huì)反饋抑制參與催化 L半胱氨酸生物合成的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，因而不能從葡萄糖大量合成L半胱氨酸 (圖 168)。實(shí)心線代表合成途徑，虛線表示反饋抑制。 由于大腸桿菌的代謝途徑以及遺傳操縱已較清晰，其操作的簡易使之成為代謝工 程的一種理想宿主，因此也可利用大腸桿菌來代替棒桿菌以及短桿菌進(jìn)行氨基酸的合成。如果將三個(gè)關(guān)鍵的酶， 3脫氧 D阿拉伯糖 庚酮糖酸 7磷酸合成酶、鄰氨基苯甲酸合成酶和鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌，色氨酸的產(chǎn)量將會(huì)更高。 (1)色氨酸工程菌的建構(gòu) 鄰氨基苯甲酸合成酶 (anthranilate synthetase)是色氨酸合成途徑中的限速酶 (圖 167)，在野生型谷氨酸棒桿菌中引入編碼該酶的基因，色氨酸的產(chǎn)量大約提高 130％。世界上第一個(gè)氨基酸的基因工程菌是產(chǎn)蘇氨酸的重組大腸桿菌，其建構(gòu)于 1980年完成，隨后又對(duì)該工程菌進(jìn)一步改造，使其蘇氨酸產(chǎn)量高達(dá) 。 ③ 將一種完整的氨基酸生物合成操縱子導(dǎo)入另一種氨基酸的生產(chǎn)菌中，建構(gòu)能同時(shí)合成兩種甚至多種氨基酸的工程菌。導(dǎo)入的限速酶基因既可以是生產(chǎn)菌自身的內(nèi) 349 源基因，也可以是來自非生產(chǎn)菌 (如大腸桿菌 )的外源基因。用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的高產(chǎn)菌株以前是利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)改良 棒桿菌(Corynebacterium spp.)的野生株，現(xiàn)在主要是利用 DNA重組技術(shù)建構(gòu)高產(chǎn)工程菌，相對(duì)傳統(tǒng)誘變技術(shù)而言，其優(yōu)點(diǎn)是：①能特異性地高效表達(dá)氨基酸生物合成途徑中的限速步驟控制基因；②能將氨基酸的生物合成控制在細(xì)菌的最佳生長階段；③能將棒桿菌有效的氨基酸生物合成和分泌系統(tǒng)移植到易于控制培養(yǎng)且生長迅速的其它細(xì)菌 (如大腸桿菌 )中。目前，全世界每年的氨基酸產(chǎn)量超過百萬噸，銷售額達(dá)幾十億美元，其中谷氨酸的產(chǎn)量占氨基酸總產(chǎn)量的一半以上。在詳盡了解乳酸桿菌代謝機(jī)制的前提下，重新設(shè)計(jì)乳糖發(fā)酵與其它細(xì)菌生長所必需的代謝途徑之間的物流控制，最大限度地提高生產(chǎn)菌的生長速度，同時(shí)阻止乳酸合成途徑或強(qiáng)化表達(dá)殺菌素合成途徑，以增加乳制品的保鮮期。要求工程菌對(duì)噬菌體具有抗性，乳糖代謝和蛋白酶合成基因能全程穩(wěn)定表達(dá)，從而提高乳糖的利用率，這在奶酪生產(chǎn)中極為重要； ② 改善發(fā)酵食品的品質(zhì)。乳酸菌具有下列共同特性：都能在較低的 pH值及厭氧條件下良好生長，其生長需要碳水化合物、氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)成分；并能利用碳水化合物生產(chǎn)大量的乳酸，產(chǎn)乳酸量 通常占發(fā)酵最終產(chǎn)物的50%以上；幾乎所有的乳酸菌都是非致病性的。我國研制的重組 大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum) HN32已 通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)審批進(jìn)行 環(huán)境釋放，該菌是世界上第二例獲準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放的重組根瘤菌。當(dāng)環(huán) 348 境中存在銨鹽時(shí)，根瘤菌的固氮能力就明顯降低，通過研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象是由于銨離子抑制了 nifA基因的表達(dá)造成的，由此構(gòu)建了不受銨阻遏的組成型表達(dá)的 nifA質(zhì)粒，將其引入根瘤菌中，得到了固氮作用不受銨阻遏的基因工程菌。 nifA基因的突變體不僅造成固氮酶活性的喪失，而且引起結(jié)瘤能力嚴(yán)重降低。 nifA基因是絕大多數(shù)固氮細(xì)菌固氮酶基因的正調(diào)節(jié)基因。③增加宿主對(duì)根瘤菌碳源和能源的供應(yīng)。提高根 瘤菌固氮能力的途徑主要有：①提高根瘤菌固氮相關(guān)的固氮酶、吸氫酶等基因的表達(dá)水平。其主要原因是在“老區(qū)”接種根瘤菌常面臨土著根瘤菌的競爭而降低了占瘤率和共生固氮效率。對(duì)根瘤菌進(jìn)行的基因