【正文】 工程研究集中在進(jìn)一步提高固氮效率和解決 “ 老區(qū)問題”。⑧復(fù)合菌肥，即將以上菌肥的兩種或多種混合施用，產(chǎn)生比單獨施用更好的效果。⑥腐熟劑，主要是加速高分子有機(jī)物分解為小分子養(yǎng)分物的腐生菌。④植物根際促生菌或 植物根圈促生細(xì)菌 (PGPR)， 又叫 ―增產(chǎn)菌 ‖或 ―多效菌劑 ‖，這是一類能在植物根部大量定殖的有益菌群，它們可抑制植物病原菌生長。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫目扇苄粤姿猁}。固氮菌可分為自生固氮菌、共生固氮菌和聯(lián)合固氮菌三類，其中與豆科植物共生的根瘤菌固氮效果最佳，因而使用也最為廣泛。微生物肥料的使用可減少化肥用量、減少能源資源消耗。 （ 二 ） 微生物肥料 利用微生物的生命活動及代謝產(chǎn)物的作用，改善作物養(yǎng)分供應(yīng)，為農(nóng)作物提供營養(yǎng)元素、生長物質(zhì)、調(diào)控生長、增強(qiáng)抗逆性，達(dá)到提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用、提高土壤肥力 的 一類生物制品就是微生物肥料。 轉(zhuǎn)基因殺蟲抗病作物的推廣，無疑對微生物農(nóng)藥 的發(fā)展形成挑戰(zhàn)，但微生物農(nóng)藥具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治對象的多樣性及生產(chǎn) 方式 的靈活性，難以被取代。將該質(zhì)粒上接合轉(zhuǎn)移必需的 tra基因刪掉后構(gòu)建的重組菌可克服這一問題，并開發(fā)成第一個商品化的重組微生物殺菌劑 Nogall，該制劑已在澳大利亞、美國、加拿大等 9個國家推廣應(yīng)用。 圖 166 螢光假單胞菌 合成蘇云金芽孢桿菌的 伴胞晶體 ， 用于開發(fā)生物囊殺蟲劑 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射農(nóng)桿菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可產(chǎn)生 農(nóng)桿菌素 (agrocin) 84, 其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效地防治根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。以下簡要舉例。將 Bt殺蚊 晶體蛋白 基因或 cry1A殺蟲晶體蛋白 基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，成功獲得殺蚊和殺蟲并 能 抗水稻紋枯病的重組菌。例如 熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)對作物病原菌具有抑菌活性 (如對小麥全蝕病菌 )以及較強(qiáng)的根部定殖能力，以這類假單胞菌為受體構(gòu)建的工程菌，能表現(xiàn)出良好的防蟲抗病活性。 由于 目前有關(guān)鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術(shù)平臺已經(jīng)建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚酮生物合成調(diào)控的分子機(jī)理的闡明，人們 已經(jīng) 能 夠 有的放矢地利用抗生素基因簇資源，提高農(nóng)用抗生素產(chǎn)量與品種。 阿維菌素是目前世界上有關(guān)生物合成基因簇研究 得 最為深入的抗生素之一， 產(chǎn)生阿維菌素的 阿維鏈霉菌（ Streptomyces avermitilis） 的全基因組測序已經(jīng)完成， 在利用基因工程進(jìn)行抗生素的人工改造方面已有了許多成功的范例。其中 pBMB801B只含有來自 Bt的 DNA片段 且含有質(zhì)粒復(fù)制區(qū)，能夠在 Bt中穩(wěn)定復(fù)制，就像 Bt的內(nèi)源質(zhì)粒一樣； pBMB801E不含在 Bt中的復(fù)制單元，隨著菌體的復(fù)制而逐漸消失。 345 圖 165 蘇云金芽孢桿菌解離載體的工作原理 erm： 紅霉素抗性基因 ； amp： 氨芐霉素抗性基因 ； ： 大腸桿菌克隆載體復(fù)制起點 ； Res:Bt轉(zhuǎn)座子 Tn4430的重組位點 (解離位點 )；cry1Ac10:殺蟲晶體蛋白基因； ori1030:來自 Bt內(nèi)源質(zhì)粒的復(fù)制區(qū) 。 為 此 ，采用了 Bt轉(zhuǎn)座子中的位點特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒的幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復(fù)制而丟失 ，保留來自 Bt的 DNA片段 。 蘇云金芽孢桿菌 表達(dá)系統(tǒng) 的構(gòu)建 涉及 以下 方面 ： 首先確定 載體的類型 , 主要是質(zhì)粒載體，同時為了復(fù) 制的穩(wěn)定，一般用 Bt自身質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)作為載體的復(fù)制單元 ，如前面所述的穿梭載體 pHT304。 （ 3）延長持效期 為了延長持效期，有人將芽孢形成較后階段的基因突變，使殺蟲基因正常表達(dá)，但芽孢不能完全成熟，細(xì)胞外殼相當(dāng)于一層生物囊可保護(hù)伴胞晶體不受紫外線（ UV）等自然條件的不利影響。高毒力生產(chǎn)菌株一般對甜菜夜蛾和鞘翅目昆蟲低毒或無毒，將 cry1C 基因或 cry3Aa 基因?qū)霂焖顾藖?種中可擴(kuò)大其殺蟲譜。通過導(dǎo)入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。為了提高目標(biāo)基因的表達(dá)量，可利用幫助蛋白基因使表達(dá)的晶體蛋白更易形成伴胞晶體而提高表達(dá)量 ，或通過更換 cry3Aa 殺蟲晶體蛋白基因 的啟動子來克服 ?因子的競爭而提高表達(dá)量。 （ 1）增強(qiáng)殺蟲毒力 通過提高某個高毒力殺蟲基因的表達(dá)量在一定程度上可增強(qiáng)殺蟲活性。 cry3Aa 殺蟲晶體蛋白基因主要來自 Bt 擬步行甲亞種 (subsp. tenebrionis)，它對鞘翅目昆蟲如馬鈴薯甲蟲有特異性毒力，目前開發(fā)的防治鞘翅目昆蟲的 蘇云金芽孢桿菌 殺蟲劑主要由該亞種制備。 Bt殺蟲蛋白 對農(nóng)業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對 人、哺乳動物以及昆蟲的天敵非常安全。 重組微生物殺蟲劑 —— 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應(yīng)用 蘇云金芽孢桿菌 是目前國內(nèi)外產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲劑。 近幾年來， 微生物 基因工程 農(nóng)藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉(zhuǎn)基因 植物進(jìn)入了實用化階段。 目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的殺蟲基因主要有 三 大類 ， 一類是從細(xì)菌中分離出來的細(xì)菌殺蟲基因 ,如 蘇云金芽孢桿菌 殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal protein)基因 ； 另一類是從植物中分離出來的植物抗蟲基因 ， 如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑 Ⅱ 基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。微生物殺蟲劑中細(xì)菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應(yīng)用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。 在接下來的內(nèi)容里，將簡單介紹一些重要的基因工程細(xì)菌。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動物、植物甚至源于人類的基因，轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細(xì)菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細(xì)菌。其基因工程的產(chǎn)品是產(chǎn)物而不是基因工程菌體本身。其二是制作生物反應(yīng) 343 器，利用細(xì)菌來生產(chǎn)某種物質(zhì)。但是隨著細(xì)胞表面展示技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)以及相關(guān)的生物技術(shù)的發(fā)展，微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用為時不遠(yuǎn)。比如利用細(xì)胞表面技術(shù)開發(fā)細(xì)胞催化劑的時候，細(xì)胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構(gòu)建細(xì)胞表面蛋白庫的時候，有些蛋白的表達(dá)量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達(dá)、多種外源蛋白的同時表達(dá)等問題。 圖 164 與細(xì)菌外膜蛋白在 N端或 C端連接的目的蛋白 (a) 外源蛋白插入到細(xì)菌外膜蛋白暴露于表面的環(huán)中； (b)形成融合蛋白； 兩種情況中，外源蛋白或肽段都是位于 細(xì)菌細(xì)胞的外表面 微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)有著廣泛的用途，可 開發(fā)一些獨特的生物產(chǎn)品如 活疫苗、細(xì)胞催化劑、細(xì)胞吸附劑、生物傳感器等，還能開發(fā)用于醫(yī)學(xué)診斷、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等的細(xì)胞受體等。為了將目的蛋白展示于微生物細(xì)胞表面，還需要構(gòu)建目的蛋白和外表面蛋白的融合。 微生物細(xì)胞表 面表達(dá)系統(tǒng) 微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)成包括載體蛋白、目的蛋白和宿主菌株三部分。 整合載體 pDG1730的整合是有針對性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構(gòu)建，以及用于其它細(xì)菌整合載體的構(gòu)建。 將 目的基因插入到 pDG1730多克隆位點（ BamHI， HindIII或 EcoRI）后，用 ScaI將重組質(zhì)粒切成線狀，再轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌，通過壯觀霉素進(jìn)行篩選。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內(nèi)部。 圖 162 pDG148Stu表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) ble：博萊霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； kan：卡那霉素抗性基因； Pspac：雜合啟動子； lacI：乳糖操縱子阻遏蛋白基因。②具有一個雜合啟動子，它來源于乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。 （ 1） 穿梭型表達(dá)載體 作為 穿梭型表達(dá)載體 (shuttle vector)， 應(yīng)同時具有大腸桿菌載體和枯草芽孢桿菌載體的復(fù)制起點 ， pDG148Stu就 是一個穿梭型表達(dá)載體 （ 圖 162），它利用大腸桿菌 pBR322和枯草芽孢桿菌載體 pVB110的復(fù)制起點 ， 能夠超量表達(dá)插入其 StuI酶切位點的外源蛋白。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達(dá)研究的有價值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)條件簡便。 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)是一種革蘭氏陽性、無莢膜、能運動的桿狀細(xì)菌 ，無致病性，對人畜無毒，是 革蘭氏陽性細(xì)菌的主要代表 。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動子 (p)的控制之下。 在其它革蘭氏 陰性細(xì)菌中所用的表達(dá)載體與此類似，但使用的并不多。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個獨立而重疊的啟動子，每一個啟動子分別負(fù)責(zé)一個 Tn5 基因的轉(zhuǎn)錄。在下面的章節(jié)里，主要介紹幾種比較常見的其他細(xì)菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和特點。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)，但是目前對其他微生物在遺傳和分子生物學(xué)方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應(yīng)用于其他一些微生物。 4. 外源基因在 細(xì)胞表面的表達(dá)（表面展示技術(shù)） 微生物 細(xì)胞表面展示（ cell surface display）技術(shù)是把目的蛋白基因序列 (外源蛋白 )與特定的載體蛋白基因序列 (又叫定位序列 )融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞，從而使目的蛋白表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)，透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性。 一些以可溶性蛋白形式表達(dá)時易被降解的蛋白質(zhì)，以包涵體形式表達(dá)時卻可以很穩(wěn)定。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細(xì)菌改造成蛋白質(zhì)分泌型。然而，僅僅是信號肽序列的存在并不能確保高效分泌，并且大腸桿菌和其他革蘭氏陰性細(xì)菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白進(jìn) 入周圍的培養(yǎng)基。 2． 構(gòu)建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質(zhì) N 端稱為信號肽 (信號序列，引導(dǎo)肽 )的一段氨基酸序列會幫助蛋白通過細(xì)胞膜。用于融合的表達(dá)標(biāo)簽 (tag)蛋白和多肽有 六聚組氨酸肽 (6xHis)和 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 (GST)。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細(xì)胞的翻譯。 3. 翻譯起始的有效性 翻譯起始是多種成分包括 mRNA、 16SrRNA、 fMettRNA，核糖體 S1蛋白、蛋白合成起始因子之間的協(xié)同作用的過程。 2. 轉(zhuǎn)錄的有效性 為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達(dá)載體上應(yīng)設(shè)法除去衰減序列 或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以避免轉(zhuǎn)錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。將 棒桿菌 (Corynebacterium sp.)的2,5DKG還原酶基因轉(zhuǎn)入歐文氏菌，能成功地將 D葡萄糖轉(zhuǎn)化成 2KLG。在細(xì)菌的代謝工程中，常見這種情況。其二是使某個關(guān)鍵基因表達(dá)，使宿主菌表現(xiàn)出一種特殊的性狀，或啟動其他產(chǎn)物的大量合成。 1. 啟動子的選擇 通過基因工程手段表達(dá)外源基因的目的大致有兩種，其一是超量表達(dá)，以達(dá)到最大限度地獲得 338 蛋白質(zhì)產(chǎn)物。例如，用于蘇云金芽孢桿菌的克隆載體 pHT304的基礎(chǔ)骨架為大腸桿菌克隆載體 pUC18, 另裝有能 在 Bt 中復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制區(qū)序列ori1030和用于選擇的紅霉素抗性基因。對于克隆載體，只要滿足在宿主菌中復(fù)制和選擇要求的載體，都可用作克隆載體。但在其他細(xì)菌中，一般沒有或很少有固定的表達(dá)系統(tǒng)，通常是將目標(biāo)基因與表達(dá)元件 (主要是相關(guān)的啟動子 )連接，再裝載在特定的克隆載體上，然后導(dǎo)入宿主菌中表達(dá)。 二、表達(dá)載體構(gòu)建原則 表達(dá)載體實際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上裝載了用于表達(dá)的一些 元件 (cassette)，當(dāng)外源基因插入到合適的位點后，在宿主菌中就可啟動表達(dá)。 關(guān)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在本書的前面章節(jié)已有詳細(xì)介紹，在此不作贅述。在細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，大腸桿菌主要作為外源蛋白超量表達(dá)的平臺，其主要目的是對不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外超量表達(dá)，從而可以 將目標(biāo)蛋白用于不同的下游領(lǐng)域，如制備基因工程疫苗、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等等。 基因工程的宿主細(xì)胞多種多樣，但目前大多數(shù)重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品都是在大腸桿菌中合成的。 外源基因的表達(dá)水平不僅與基因的來源、基因的性質(zhì)以及載體有關(guān)，還取決于宿主細(xì)胞。為此，要嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例的要求，認(rèn)真開展重組細(xì)菌的生物安全性評價研究。同時要注意革新細(xì)菌基因工程菌的生產(chǎn)工藝，發(fā)展適用的加工劑型，盡快提高 ―下游 ‖技術(shù)的水平。微生物的生活環(huán)境高度多樣化，種類繁多，這就決定了微生物所表現(xiàn)的性狀豐富多彩，蘊藏著為人類服務(wù)的巨大潛力。由我國學(xué)者研制的轉(zhuǎn) ntrCnifA基因固氮斯氏假單胞菌 AC1541和蘇云金芽孢桿菌