【正文】 震蕩45min。3. 加入5μL連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過(guò)100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。3．材料 感受態(tài)細(xì)菌，質(zhì)粒【實(shí)驗(yàn)方法】1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。（6） 2%（M/V）Xgal：用N,N二甲基甲酰胺配制，過(guò)濾除菌，鋁箔封裹避光20176。（3） LB平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂，高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100μg/mL，每個(gè)培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。（2） 氨芐青霉素儲(chǔ)存液：無(wú)菌水配制100mg/mL，20176。C 20min滅菌。培養(yǎng)皿、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。如果轉(zhuǎn)化成功，獲得外源質(zhì)粒的受體菌能夠依靠質(zhì)粒上的抗菌素抗性基因在選擇平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，沒(méi)有獲得外源質(zhì)粒的菌體將被抗菌素殺死。C短時(shí)間的熱休克處理，促進(jìn)其吸收DNA?！舅伎碱}】1. 制作感受太菌的過(guò)程中，應(yīng)注意那些關(guān)鍵步驟？2. CaCl2溶液的作用是什么？為什么要冰冷的？實(shí)驗(yàn)八 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術(shù)。以后用的時(shí)候每次用完一管，不可反復(fù)凍融。棄上清液后，用200μL mol/L CaCl2溶液垂懸。棄上清液后，用1mL mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。加入1mL mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。5. ，于冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min離心10min。以下操作除離心外，都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。3. LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h。2. 從超低溫冰柜中取出DH5a菌種和BL21(DE3)菌種，放置在冰上。C 20min滅菌后存放在冰箱。C 20min滅菌。搖菌試管、三角燒瓶、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。C的 CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。C下連接？3. 如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？實(shí)驗(yàn)七 感受態(tài)大腸桿菌的制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。C冰箱備用。C水中）中保溫過(guò)夜。2. DNA回收片斷（NK）與表達(dá)載體（pETTrx）連接：（1） ，加入：NK片段回收產(chǎn)物 4mLpETTrx載體酶切回收產(chǎn)物 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/uL） 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL（2） 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14176。（4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八）或置4176。（2） ，加入：PCR 產(chǎn)物混合液 4mLpMD19T載體 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul） 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL （3） 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14176。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片斷【實(shí)驗(yàn)方法】1. PCR產(chǎn)物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或泡沫塑料保溫盒里的水）溫度調(diào)整到14176。2．試劑（1） T4 DNA 連接酶（2） 連接酶緩沖液（3） 無(wú)菌dd Water等3．材料（1） pMD19T 載體。 【實(shí)驗(yàn)用品】1. 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺(tái)式離心機(jī)，干式恒溫氣浴，恒溫水浴，泡沫塑料保溫盒?！舅伎碱}】1. 為何避免用EB染色及用紫外燈照射欲回收的目的DNA？實(shí)驗(yàn)六 目的基因片段與載體連接【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)DNA片斷的體外連接技術(shù)。8. 可取2μl5μl回收產(chǎn)物電泳，檢測(cè)是否有回收到的目的DNA帶。⑧8000r/min室溫離心1min，離心管中的液體就是回收產(chǎn)物。⑥取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回到同一個(gè)收集管中，12000r/min室溫離心1min。④將UNIQ10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500mL Wash Solution，5000r/min室溫離心1min。③5000r/min室溫離心1min。例如：（1）上海生工 UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟： ①按400mL/100mg凝膠的比例加入Binding Buffer II，置于5060℃水浴中10min，每2min混勻一次，使膠徹底熔化。7. 按照DNA凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書操作，回收DNA酶切產(chǎn)物。再稱量后計(jì)算出其中膠塊的重量。4. 將做好切口標(biāo)記的凝膠條用保鮮膜包住，與未染色的凝膠原位對(duì)齊，根據(jù)小膠條上的切口標(biāo)記估計(jì)未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置。在紫外燈下找到目的DNA帶，用刀片在目的DNA帶的下上下邊緣各切一個(gè)小口作為標(biāo)記。2. 在膠上選定兩個(gè)相鄰的加樣孔，分別加入少量（10μL）（一般選擇位于凝膠的邊緣）和大量（30～50μL ）DNA酶切產(chǎn)物，電泳（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二）。加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等（6） 電泳級(jí)瓊脂糖粉（7） DNA凝膠回收試劑盒 3. 材料欲回收的DNA酶切產(chǎn)物：pETTrx載體的EcoRI +BamHI酶切產(chǎn)物，pMD19TNK的EcoRI +BamHI酶切產(chǎn)物【實(shí)驗(yàn)方法】1. 用1180。使用時(shí)在蒸餾水里滴入適量，使水看起來(lái)微微發(fā)紅即可（3） 10180。溴化乙錠儲(chǔ)存液（）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4176。使用時(shí)稀釋成1180。TAE電泳緩沖液（）：Tris堿 242g， Na2EDTA 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅活。經(jīng)過(guò)乙醇洗滌雜質(zhì)后，用TE緩沖液洗滌柱子即可回收目的DNA酶切片斷?！緦?shí)驗(yàn)原理】限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片斷經(jīng)過(guò)電泳后，按分子量大小被分開(kāi)，排列在瓊脂糖凝膠中。6. PCR產(chǎn)物可以直接與T載體連接（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六），然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八）。觀察膠上是否有預(yù)計(jì)分子量的主要產(chǎn)物帶。C 1min50s （根據(jù)所擴(kuò)增的DNA的長(zhǎng)度設(shè)定）（5） go to（2） 29 times（6） 72176。C 1min （3） 60176。（以下加樣量供參考，括號(hào)內(nèi)是最終濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)需參照Taq酶說(shuō)明書計(jì)算） dd water 32μL 10PCR buffer（不含MgCl2） 5μL 25mM MgCl2 3μL （） 10μmol/L Primer1 2μL（—25pmoles） 10μmol/L primer2 2μL（—25pmoles） 模板質(zhì)粒pMD18TNK 1μL（1103pmoles） 3U/μL Taq酶 1μL（3U） 總體積 50μL3. 根據(jù)PCR儀的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序：（1） 94176?！緦?shí)驗(yàn)方法】1. 取1μL自己提取的質(zhì)粒pMD18TNK，加入9μL dd water稀釋作為PCR模板。GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG339。GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC339。加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（3） 10180。C避光儲(chǔ)存。（2） 1000180。2H2O，dd water 定容至1L。2．試劑（1） 50180?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，PCR儀，臺(tái)式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。一般取低于Tm值25176。再進(jìn)入下一輪變性—復(fù)性—延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴(kuò)增（1+X）n倍。【思考題】1. 酶切反應(yīng)混合物的體積是否對(duì)酶切效果有影響？為什么？ 2. 如何估計(jì)DNA用量和酶的用量？3. 在吸取內(nèi)切酶的時(shí)候如何操作才能避免浪費(fèi)？實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增制備目的基因【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)PCR儀的設(shè)置和PCR操作的基本技術(shù)。7. 清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。根據(jù)已知的酶切位點(diǎn)，判斷酶切結(jié)果。注意不同的內(nèi)切酶的最適酶切溫度不同。取出后插到水漂的孔中，在37176。吸完酶后立即把內(nèi)切酶液送回冰柜！4. 在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后，輕輕震動(dòng)微量離心管，使管中的溶液混勻。3. 用一只手的手指捏住盛放酶的微量離心管的上部（以免手指給酶液加溫），另一只手持10μL微量移液器，讓吸頭尖部剛好伸進(jìn)酶液即可，吸取1 μL EcoRI限制性內(nèi)切酶。：自提的pETTrx 質(zhì)粒DNA 8 μL10酶切緩沖液（用BamHI的緩沖液） 4 μLdd water 26 μLEcoRI 1μLBamHI 1μL總體積 40μL2. 加完質(zhì)粒、緩沖液和水后，從30176。加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。（3） 10180。C避光儲(chǔ)存。（2） 1000180。2H2O，dd water 定容至1L。2. 試劑（1） 50180。【實(shí)驗(yàn)用品】1. 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴鍋?！緦?shí)驗(yàn)原理】 II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過(guò)電泳把酶切后的DNA片段混合物分離。13. 撰寫實(shí)驗(yàn)記錄。12. 染有EB的凝膠和手套（只要手套沒(méi)破，可以節(jié)約使用：將手套脫下來(lái)以后張開(kāi)口放在染色區(qū)，下一次把手伸進(jìn)去即可）要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境。用自來(lái)水沖洗后放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。以下需戴手套到專門的染色區(qū)操作。將沒(méi)有使用的凝膠部分切下來(lái)收入溶膠瓶，回收再用。10. 當(dāng)藍(lán)色的溴酚藍(lán)遷移到距凝膠邊緣1cm時(shí)，關(guān)閉電源。樣品將形成一條藍(lán)色的橫帶向前移動(dòng)（如果發(fā)現(xiàn)藍(lán)色向后移動(dòng)，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。在電泳PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物時(shí)，在相鄰的加樣孔中加入2mL DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。加樣時(shí)持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手指夾住移液器下部，以減少移液器的抖動(dòng)。8. 在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。加樣緩沖液，再加入3mL質(zhì)粒DNA溶液制成10mL DNA混合樣品。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負(fù)極（黑色電極）。6. 待膠完全凝固后（15～20分鐘），小心拔出梳子。TAE電泳緩沖液。（如有剩下的膠溶液，封口后留待以后再熔化使用）。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相差1～2mm即可，但盡量不要太厚，更不要把膠溶液溢到外面。C）。2. 注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。如果電泳樣品少的話，可與其他組共用一塊膠，或在電泳結(jié)束后將帶有DNA的膠切下來(lái)放入EB染色，剩下的膠塊用保鮮膜包住放到4176。25mL 正好能倒?jié)M一塊小膠。TAE電泳緩沖液（注意原液是50180。 （6） 電泳級(jí)瓊脂糖粉3. 材料pETTrx質(zhì)粒，pMD18TNK質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物或DNA酶切產(chǎn)物等。加樣緩沖液：20% Ficoll 400，% SDS，%溴酚藍(lán)（4） 6180。使用時(shí)在蒸餾水里滴入適量，使水看起來(lái)微微發(fā)紅即可。溴化乙錠儲(chǔ)存液（）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4176。使用時(shí)稀釋成1180。TAE電泳緩沖液（）：Tris堿 242g， Na2EDTA250mL三角瓶，微波爐，臺(tái)式離心機(jī)，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，試管架，一次性薄膜手套等。不同長(zhǎng)度和形態(tài)的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開(kāi)。稀釋倍數(shù)【思考題】1. 影響最終質(zhì)粒產(chǎn)量的主要因素有哪些？2. 提取到的質(zhì)粒純度將直接影響到以后的酶切效果，如何操作才能盡可能地避免蛋白質(zhì)的污染？實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA電泳鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)常用的D