【正文】 可使藍(lán)色樣品流到孔外。9. 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，170V電泳。電泳將進(jìn)行約30min。取出模具和凝膠。11. 把帶有樣品的凝膠小心放入盛有EB的搪瓷盒中。放置約10分鐘后，取出來(lái)在自來(lái)水中浸泡10min。照片要以合適的文件名保存，以便寫(xiě)論文的時(shí)候調(diào)用。不可用接觸過(guò)EB的手套接觸電腦或凝膠成像儀的門(mén)?！舅伎碱}】1. 泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？2. 溴酚藍(lán)的遷移率相當(dāng)于多少bp的DNA?3. 影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的酶切【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)用限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA?？筛鶕?jù)DNA上已知的酶切位點(diǎn)和預(yù)期的酶切結(jié)果，與DNA分子量Marker對(duì)比，判斷酶切是否成功。移液器吸頭、。TAE電泳緩沖液（）：Tris堿 242g， Na2EDTA使用時(shí)稀釋成1180。溴化乙錠儲(chǔ)存液（）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4176。使用時(shí)在蒸餾水里滴入適量，使水看起來(lái)微微發(fā)紅即可。加樣緩沖液：20% Ficoll 400，% SDS，%溴酚藍(lán)（4） 6180。 （6） 電泳級(jí)瓊脂糖粉（7） EcoR I和BamH I內(nèi)切酶，10內(nèi)切酶緩沖液3. 材料pETTrx質(zhì)粒【實(shí)驗(yàn)方法】1. 先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。C冰柜中取出限制性?xún)?nèi)切酶，立即插入冰塊中。更換吸頭后吸取1 μL BamHI限制性?xún)?nèi)酶。再在離心機(jī)中2000r/min離心10秒。C水浴中酶切34 h。5. 取少量（約10μL）酶切產(chǎn)物，與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物或Marker等）對(duì)比電泳（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二），以確認(rèn)酶切是否成功。6. 酶切后的目的片斷可以回收備用（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五）。撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄。【實(shí)驗(yàn)原理】 將待擴(kuò)增的DNA模板加熱至94變性，再降低溫度與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過(guò)耐熱的DNA聚合酶延伸。復(fù)性溫度可根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6或Primer5給出的引物Tm值確定，其中25nt的引物的Tm值也可以用公式Tm=2（A+T）+4（G+C）計(jì)算。C。移液器吸頭、 PCR微量管分別高壓滅活。TAE電泳緩沖液（）：Tris堿 242g， Na2EDTA使用時(shí)稀釋成1180。溴化乙錠儲(chǔ)存液（）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4176。使用時(shí)在蒸餾水里滴入適量，使水看起來(lái)微微發(fā)紅即可。加樣緩沖液：20% Ficoll 400，% SDS，%溴酚藍(lán)（4） 6180。 （6） 電泳級(jí)瓊脂糖粉（7） 3U/μL Taq DNA聚合酶（8） 10PCR緩沖液（MgCl2 free）（9） 25mM MgCl2（10） dNTP混合液（每種25mM）（11） 無(wú)菌dd water3．材料（1） 模板質(zhì)粒pMD18TNK：已經(jīng)克隆在pMD18T載體上的1181bp納豆激酶（nattokinase，NK）基因（2） NK引物：上游引物（5’端帶BamHI酶切位點(diǎn)）539。下游引物（5’端帶EcoRI 酶切位點(diǎn)）539。 待擴(kuò)增的NK片段長(zhǎng)度：837bp（825bp NK+5’BamH I位點(diǎn)GGATCC，3’EcoRI位點(diǎn)GAATTC）。2. PCR 微量離心管中按下列參考劑量配制50μL反應(yīng)體系。C 5min （2） 94176。C 1min （根據(jù)引物的Tm值設(shè)定）（4） 72176。C 10min4. PCR結(jié)束后，取5～10μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二）。5. 清理桌面，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄?！舅伎碱}】1. 復(fù)性溫度是根據(jù)什么確定的？2. 引物序列是根據(jù)什么設(shè)計(jì)的？為什么要加上酶切位點(diǎn)序列？3. 為什么要在最后延伸10min？4. 實(shí)驗(yàn)中是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體帶？如何才能消除？ 實(shí)驗(yàn)五 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會(huì)用從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷。因此可以將某條特定的DNA帶所在的凝膠切下來(lái)，加熱或用特殊的試劑熔解，使DNA回溶到溶液中，再經(jīng)過(guò)過(guò)柱，DNA片段被吸附到柱上，與溶液其它成分分開(kāi)?！緦?shí)驗(yàn)用品】1. 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺(tái)式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，微波爐，水漂，恒溫水浴鍋，DNA凝膠回收試劑盒的柱子。2. 試劑（1） 50180。2H2O，dd water 定容至1L。（2） 1000180。C避光儲(chǔ)存。加樣緩沖液：20% Ficoll 400，% SDS，%溴酚藍(lán)（4） 6180。TAE配制1%瓊脂糖凝膠，使用較寬的梳子制備加樣孔。3. 電泳結(jié)束后用薄塑料片（如電話(huà)卡）切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道，EB染色。含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用EB染色，也不用紫外燈照射。5. 用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠（盡量不要多余的凝膠），轉(zhuǎn)移至一個(gè)事先稱(chēng)量過(guò)的、。6. 再用EB染色切除DNA以后的大膠，與小膠條并在一起在紫外燈下檢查是否已把DNA帶切走。不同的試劑盒的操作原理相同，但步驟稍有差別，應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。②將熔化的膠溶液移到套放在2mL收集管內(nèi)的UNIQ10柱中，室溫放置2min。取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液。⑤重復(fù)上一步洗滌一次。⑦，在柱子膜中央加30mL Elution Buffer（或dd water，pH），室溫或37℃放置2min（5580℃洗脫效果更好）。（2）其它公司的試劑盒（如AXYGEN公司的AXYprep? DNA Gel Extraction Kit）的操作步驟與上述大同小異，做實(shí)驗(yàn)時(shí)按照各家的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作即可。9. 清理桌面，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄。【實(shí)驗(yàn)原理】 在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅活。NK PCR產(chǎn)物（2） EcoRI +BamHI酶切回收的pETTrx載體。C。C水中保溫過(guò)夜。C冰箱備用。C干式恒溫儀（或14176。（3） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八）或置4176?！舅伎碱}】1. 連接酶的最適活性溫度是多少？2. 為什么要采用14176?！緦?shí)驗(yàn)原理】 細(xì)菌在0176?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，接種環(huán)。2．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。（2） mol/L CaCl2溶液，121176。（3） 無(wú)菌dd Water3．材料E. coli DH5a，E. coli BL21（DE3）【實(shí)驗(yàn)方法】1. 取一支無(wú)菌的搖菌試管，在超凈工作臺(tái)中加入2mL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素?。?。在超凈工作臺(tái)中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含2mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。4. （~，細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)?。?。如果有大型冷凍離心機(jī)則應(yīng)當(dāng)使用50mL離心管離心集菌和CaCl2處理。6. 棄上清，并將離心管倒置以倒盡上清液。7. 4℃，5000r/min離心10min。8. 4℃，5000r/min離心10min。9. 分裝好的感受態(tài)菌可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八），或立即放入80℃超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。10. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄?！緦?shí)驗(yàn)原理】 質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)42176。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中篩選?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。4．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。使用時(shí)可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。C保存。（4） 無(wú)菌dd water（5） 20%（M/V）IPTG：無(wú)菌水配制，過(guò)濾滅菌。C保存。2. 從80℃ 超低溫冰柜中取出一管（50μL）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。6. 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液50~300μL（根據(jù)轉(zhuǎn)化效率和載體連接效率而定），滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中。7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話(huà)，滴完菌液后再在平板上滴加40μL 2% Xgal，7μL 20% IPTG，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄。挑選白色菌斑進(jìn)行篩選和鑒定（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)九）?！緦?shí)驗(yàn)原理】 利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。選擇一定數(shù)目的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，如果切出預(yù)期的DNA片段，說(shuō)明質(zhì)粒上插入了外源DNA片段。【實(shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機(jī)，PCR儀，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈。2．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。使用時(shí)可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。C保存。（4） 無(wú)菌dd water（5） 20（M/V）%IPTG：無(wú)菌水配制，過(guò)濾滅菌。（7） 50180。2H2O，dd water 定容至1L。（8） 1000180。C避光儲(chǔ)存。（9） 10180。加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液（11） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。2. PCR 微量離心管中配制25μL反應(yīng)體系（方法參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四）。C 5min （2） 94176。C 1min （根據(jù)引物的Tm值設(shè)定）（4） 72176。C 10min4. PCR結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)電泳）。5. 按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。方法二：酶切鑒定1. 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取3個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。3. 在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡過(guò)的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。4. 37℃搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)一）。5. 將提取到的3管質(zhì)粒樣品與已知分子量的質(zhì)粒同時(shí)電泳（方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二），先根據(jù)分子量判斷和選取有插入片段的質(zhì)粒。8. 將經(jīng)過(guò)鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)?；蜻M(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后80℃保存菌種?！舅伎碱}】1. PCR法篩選的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)是什么？2. 酶切法與PCR法篩選方案哪個(gè)更可靠？3. 最終確認(rèn)克隆的方法有哪些？實(shí)驗(yàn)十 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私馔庠椿蛟谠思?xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的方法。lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄。表達(dá)的蛋白可用SDSPAGE或Westernblotting檢測(cè)。三角燒瓶、搖菌管、。C 20min滅菌。（2） 氨芐青霉素儲(chǔ)存液：無(wú)菌水配制100mg/mL，20176。（3） 無(wú)菌dd water（4） 100mg/mL（M/V）IPTG：無(wú)菌水配制，過(guò)濾除菌（5） 20%葡萄糖：8磅滅菌20分鐘。C搖菌至OD600=，此為關(guān)鍵）?！?h。5. 菌體可以進(jìn)行SDS—PAGE電泳分析（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十一），也可放在20176。6. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄。【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)在加熱變性以后與SDS結(jié)合，帶上負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，向正極移動(dòng)，結(jié)果按分子量大小排列在膠板的不同位置上，經(jīng)考馬斯亮蘭染色后可觀察到蛋白質(zhì)帶。根據(jù)目的基因在載體上從起始密碼至終止密碼的編碼堿基數(shù)目估計(jì)表達(dá)產(chǎn)物的分子量（1kb 104道爾頓蛋白質(zhì)）。2．試劑（1） ： Tris堿, 加50mL蒸餾水，（約加8mL）。高溫高壓滅菌后4176。高溫高壓滅菌后4176。C棕色瓶避光保存，可用一個(gè)月（5） 10%Aps（過(guò)硫酸氨）：蒸餾水配制，20176。過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，一周內(nèi)使用完。上樣緩沖液：， 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，%溴酚藍(lán) ，b2巰基乙醇 ，dd water ，室溫存放（7） 5180。使用時(shí)稀釋5倍（8） TEMED（(N,N,N’N’四甲基乙二胺）（9） 低分子量蛋白分子量Marker：，43，31， kDa（10） 考馬斯亮藍(lán)R250染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 + 45mL甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL（11）