【正文】 V10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒 pRK290 的 多克隆位點(diǎn)中插入來源于轉(zhuǎn)座子 Tn5 末端反向重復(fù)序列的一段 70bp DNA 而構(gòu)建的 (圖 161)。 Tn5 能有效地作用于許多細(xì)菌宿主，它的啟動(dòng)子也能促進(jìn)這些生物的轉(zhuǎn)錄。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個(gè) BglII 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；復(fù)制起點(diǎn) (ori)；啟動(dòng)子 (p)；多克隆位點(diǎn) (MCS)。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。它 最顯著的特點(diǎn)是在極端生長條件或生命后期在細(xì)胞內(nèi)形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強(qiáng)的抗逆境能力。 下面介紹兩個(gè)應(yīng)用于枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體。 pDG148Stu克隆表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因 lacI及其調(diào)控序列，使外源蛋白的表達(dá)受 IPTG的調(diào)控。③ 3個(gè)抗性基因作為篩選標(biāo)記， kan（卡那霉素抗性基因）和 ble(博萊霉素抗性基因）可同時(shí)用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗性篩選， bla（氨芐霉素抗性基因）只能用于大腸桿菌的抗性標(biāo)記。 （ 2）整合載體 能 將目標(biāo)基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實(shí)現(xiàn)外源基因的整合。該載體的基本骨架是大腸桿菌的克隆載體和用于革 341 蘭氏陽性細(xì)菌的紅霉素抗性選擇標(biāo)記基因 (erm)；用作整合的元件是中間插入了壯觀霉素抗性基因(spc)的 ?淀粉酶基因，并且其中含有多克隆位點(diǎn) (圖 163)。只有當(dāng)載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗性基因 （ spc） 替換染色體上同源序列之間的區(qū)域，整合到染色體后， 壯觀霉素的抗性才能表現(xiàn)出來。 圖 163 整合載體 pDG1730結(jié)構(gòu)示意圖 erm：紅霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； spc：壯觀霉素抗性基因； amyE’ :?淀粉酶基因上游片段； ’ amyE:?淀粉酶基因下游片段 。 位于細(xì)胞表面的 342 蛋白都可用于細(xì)胞表面展示，常見的載體蛋白包括大腸桿菌的外膜蛋白 (如 OmpA和 OmpC)和與肽聚糖相關(guān)的 脂蛋白 (Peptidoglycanassociated lipoprotein， PAL)，假單胞菌 (Pseudomonas spp)的外膜蛋白F(OprF)和 冰核蛋白 INP(Ice Nucleation Protein)， 蠟狀芽孢桿菌群 (Bacillus cereus group)的 S層表面蛋白 (Surface layer protein, Slayer protein)， 葡萄球菌 的表面 蛋白 A(SpA)， 胞外附屬結(jié)構(gòu) (如鞭毛 )的蛋白等 。在大多數(shù)細(xì)菌表面融合蛋白中，目的蛋白位于融合蛋白的 N端或 C端，有時(shí)目的蛋白的短片段也可以在融合蛋白的中間表達(dá) (圖 )。 盡管現(xiàn)在已經(jīng)成功開發(fā)了一些細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多問題需要解決。因此對細(xì)胞表面技術(shù)的研究和應(yīng)用目前只是停 留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有工業(yè)化。 第三節(jié) 細(xì)菌基因工程的應(yīng)用 基因工程的實(shí)踐主要有三種表現(xiàn)形式，其一是改造細(xì)菌使之性狀得到遺傳改良，獲得更好的應(yīng)用效果，如殺蟲、固氮等，在這種情況下，基因工程的產(chǎn)品仍然是細(xì)菌本身。最典型的是大腸桿菌反應(yīng)器，用來生產(chǎn)多種酶類和多肽（如基因操作中的酶制劑幾乎都是基因工程產(chǎn)品）。還 有一類中間狀態(tài)的類型，即基因工程改造的是細(xì)菌本身，但需要的是產(chǎn)物或改造的產(chǎn)物， 通常為了得到某些高表達(dá)量的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，會(huì)對某些細(xì)菌進(jìn)行必要的遺傳學(xué)改造，將某些與目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)入到合適的細(xì)菌，這就相當(dāng)于在宿主菌中重新載入了或加強(qiáng)了某條生理代謝途徑，從而在宿主細(xì)菌中得到理想的細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物， 如通過基因工程改造后提高某種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或去除了雜質(zhì)產(chǎn)物，或產(chǎn)生一種新的代謝產(chǎn)物（如鏈霉菌中的新抗生素的合成）等。這些基因工程細(xì)菌在過去的十幾年內(nèi)開始大量應(yīng)用于衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等諸多行業(yè)和領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 一、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因工程細(xì)菌 (一 ) 微生物基因工程農(nóng)藥 目前微生物農(nóng)藥主要有微生物殺蟲劑、微生物殺菌劑、微生物除草劑及利用微生物代謝分泌的有效活性物質(zhì)制成的農(nóng)用抗生素殺蟲、殺菌劑 等 。利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物 來 防治作物病蟲害已取得了較為理想的效果 ， 對人畜和生態(tài)環(huán)境十分安全，已成為植物保護(hù)發(fā)展的重要方向。 此外還有其他來源的 蝎毒基因 aaIT、桿狀病毒 egt 基因、白葉枯病菌致病基 因 hrp、抗馬鈴薯晚疫病的 osmotin 基因、病毒增效因子序列、桿狀病毒抗凋亡基因、幾丁質(zhì)酶基因 等 。這一發(fā)展顯示出生物技術(shù)用于生防微生物遺傳改良的巨大潛力，并為新一代微生物農(nóng)藥的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 Bt在其生長過程中產(chǎn)生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ ICPs）， 主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆 蟲幼蟲以及原生動(dòng)物門、螨類、扁形動(dòng)物門等類群。 近年來， 從 Bt 中發(fā)現(xiàn)并正式命名的 ICP 基因已有近 50 大類，總數(shù)超過 250 種， 其中 cry1Aa 、 344 cry1Ab 和 cry1Ac 三個(gè)基因是殺蟲毒力最高的基因種類，主要存在于庫斯塔克亞種 (subsp. kurstaki)中，其作用對象也是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中最重要的一類害蟲，如危害蔬菜、棉花、玉米、水稻、煙草以及森林等的鱗翅目昆蟲。 通過基因工程技術(shù)改造 Bt 主 要是為了增強(qiáng)殺蟲毒力、拓寬殺蟲范圍、延長持效期、克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性等。例如將 cry1Ac 殺蟲基因?qū)敫叨玖ιa(chǎn)菌株（一般都是庫斯塔克亞種），可增加其殺蟲活性。我國通過這種方法構(gòu)建的高毒力 Bt 菌株已通過農(nóng)業(yè)基因工程安全審批完成了商品化生產(chǎn)試驗(yàn)。 （ 2）拓寬殺蟲范圍 Bt 的殺蟲基因的活性范圍各不相同，不同的菌株所含的殺蟲基因的種類和數(shù)量也不同，因此不同菌株的殺蟲活性和殺蟲范圍各不相同。相關(guān)的基因工程菌株已有部分進(jìn)入“環(huán)境釋放”試驗(yàn)。 （ 4）克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性 來自以色列亞種的 cyt1A 基因具有克服昆蟲抗性的能力，人們已經(jīng)將該基因?qū)霂焖顾藖喎N中以期延長可能出現(xiàn)的昆蟲抗性問題。但是，為了最大限度地保證基因工程菌環(huán)境釋放的安全性，要求將載體中的非 Bt來源的 DNA片段去掉，如抗生素抗性基因以及來自大腸桿菌的 DNA片段。這種載體稱為 解離載體 ，其工作過程見圖 165。當(dāng)重組質(zhì)粒 pBMB801進(jìn)入 Bt菌后，再通過溫度敏感復(fù)制的輔助質(zhì)粒將解離酶基因 tnpI導(dǎo)入重組菌，由此導(dǎo)致兩個(gè) res位點(diǎn)之間發(fā)生重組，從而形成兩個(gè)質(zhì)粒。 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的遺傳操作 農(nóng)用抗生素是由抗生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的具有農(nóng)藥功能的次生代謝物質(zhì)，它是有明確分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)，如 阿維菌素（ Avermectin） 、 鏈霉素 (Streptomycin)和 日光霉素 (Nikkomycin)等，具有殺蟲、殺螨、殺線蟲或殺真菌活性。 我國通過缺失其生物合成途徑中的 C50甲基轉(zhuǎn)移酶而阻斷支路代謝，獲得了僅產(chǎn) B 組分的工程菌，這種微生物農(nóng)藥更加高效和低毒，還大通過輔助質(zhì)粒導(dǎo)入 tnpI 基因 346 大簡化工藝流程和降低生產(chǎn)成本。 殺蟲抗病重組 微生物 許多細(xì)菌具有殺死或抑制植物病原菌的作用，或具有促進(jìn)植物生長的作用，或在植物的葉面或根部具有優(yōu)勢定殖能力，將殺蟲基因?qū)脒@些細(xì)菌，可以獲得改良的殺蟲細(xì)菌。 有些 枯草芽孢桿菌能穩(wěn)定地在土壤和植物表面定殖 ， 產(chǎn)生抗生素 ， 分泌刺激植物生長的激素 ， 并能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，是一種理想的微生物殺菌劑，有廣闊的應(yīng)用前景。 4．其它重組殺蟲抗病微生物 微生物種類繁多，生物性狀豐富，構(gòu)建出的殺蟲抗病重組菌也非常多。 （ 1）生物囊殺蟲劑 將 Bt毒素蛋白基因轉(zhuǎn)入螢光假單胞菌中， 使其高效表達(dá)并形成伴胞晶體，發(fā)酵后通過物理和化學(xué)方法將菌體殺死但不破壞伴胞晶體而且菌體外形保持完整，從而形成一種生物囊制劑（圖 166），這種制劑在田間應(yīng)用時(shí)其有效期平均增加了兩百多倍， 對小菜蛾的殺蟲效果與化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)，無污染環(huán)境的副 作用，成為一種新型的微生物殺蟲劑，用于蔬菜害蟲防治。但在該菌的質(zhì)粒 pAgK84上含有抗該核苷酸桿菌素的 抗性基因，在應(yīng)用過程中該質(zhì)粒會(huì)通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)到病原菌中，從而使病原菌獲得抗性，防病效果大大降低。 （ 3） 殺蟲抗病工程菌 將具有抑制歐文氏菌病原基因表達(dá)的 aii基因（ AHL內(nèi)酯酶）通過 S 347 層蛋白為載體在 Bt細(xì)胞表面表達(dá)，構(gòu)建出殺蟲抗病工程菌，在魔芋田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出對軟腐病菌的良好抗病效果?？梢云诖⑸锓乐卧诘蜌埗?、難以產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，借助基因工程的方法能合成或創(chuàng)造出更多新的產(chǎn)物以提高生物農(nóng)藥的穩(wěn)定性及作用效率，微生物農(nóng)藥 依 然有著良好的發(fā)展前景。這類制品都有一個(gè)共同的 特點(diǎn)，即含有一定量的特定功能的微生物，而且這些活體微生物起著重要作用 。 微生物肥料主要有以下種類：①固氮菌，主要利用自身的固氮能力，將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)變?yōu)橹参锟梢晕绽玫匿@鹽等氮源。 根瘤菌肥料是世界各國應(yīng)用最多的微生物肥料 。 ③解鉀菌，主要是 膠質(zhì)芽孢桿菌（ Bacillus mucilaginosus,又名硅酸鹽細(xì)菌），可把鉀元素從不溶性含鉀礦石中釋放出來，供植物吸收利用。⑤ VA菌根真菌，它是一類與植物根系共生的真菌，幫助植物吸收多種礦質(zhì)營養(yǎng)成分，特別是磷素營養(yǎng)。⑦光合細(xì)菌，如紅螺菌等，它們能夠?yàn)樽魑锾峁┎糠痔荚春鸵恍┯幸娴拇x物 。 目前，應(yīng)用最廣、影響最大的微生物肥料為基因工程固氮菌?！袄蠀^(qū)問題 ” 指的是根瘤菌劑接種在從未種植過相應(yīng)豆科植物的“新區(qū)”時(shí)增產(chǎn)效果顯著，而在多年種植的“老區(qū)”效果不穩(wěn)定。解決“老區(qū)問題 ” 的方法主要有使接種菌產(chǎn)生能夠抑制土著菌的抗菌素以及導(dǎo)入競爭結(jié)瘤相關(guān)基因增加菌劑的結(jié)瘤能力等。②降低土壤中銨離子對根瘤菌固氮能力的抑制作用。 固氮是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，需要許多不同蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)作用。 NifA蛋白不但能夠與固氮酶基因 nifHDK啟動(dòng)子結(jié)合，提高其轉(zhuǎn)錄效率，而且調(diào)控根瘤菌的結(jié)瘤能力。相反，當(dāng)引入了多拷貝的 nifA基因后，根瘤菌的固氮酶活性和結(jié)瘤能力都 有顯著的提高。 在美國，基因組中整合了外源 dctABD基因的重組苜蓿根瘤菌能提高大田苜蓿產(chǎn)量，是世界上首例通過了遺傳工程菌安全性評價(jià)并進(jìn)入有限商品化生產(chǎn)的工程根瘤菌。 二、食品和工業(yè)基因工程菌 （ 一 ） 乳酸菌基因工程菌 乳酸菌是一類以乳酸發(fā)酵為基本特征的革蘭氏陽性菌群 ， 包括 乳酸桿菌 (Lactobacillus)、 乳球菌(Lactococcus)、 鏈球菌 (Streptococcus)、 片球菌 (Pediococcus)和 明串球菌 (Leuconostoc)五個(gè)菌屬。 乳酸菌基因工程的改良主要包括三個(gè)方面： ① 提高生產(chǎn)菌在食品發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性。控制蛋白酶基因的表達(dá)程度可以優(yōu)化發(fā)酵乳制品的組成，提高其營養(yǎng)價(jià)值；在生產(chǎn)菌中導(dǎo)入某些天然香料的生物合成基因以及甜味蛋白或多肽基因，可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味和口感； ③ 縮短生產(chǎn)時(shí)期。 （二） 生產(chǎn)食品添加劑的基因工程菌 1． 氨基酸工程菌 氨基酸在食品工業(yè)具有廣泛的用途，可以用作增鮮劑 (味精 )、抗氧化劑和營養(yǎng)補(bǔ)充劑，在其他行業(yè)用途也很廣泛。氨基酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，主 要有蛋白質(zhì)降解和微生物發(fā)酵兩種方法。 目前 ， 氨基酸工程菌的構(gòu)建工作主要集中在以下三方面 ： ① 借助于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將氨基酸生物合成途徑中的限速基因?qū)肷a(chǎn)菌中，增加其表達(dá)量。 ② 采取類似的方法，強(qiáng)化表達(dá)氨基酸輸出系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，或者降低某些基因產(chǎn)物的表達(dá)速率，最大限度地解除氨基酸及其生物合成中間產(chǎn)物對其生物合成途徑可能造成的反饋抑制。 與其它 多種革蘭氏陽性菌不同， 谷氨酸棒桿菌 (C. glutamicum)能夠識(shí)別包括革蘭氏陰性菌在內(nèi)的許多原核細(xì)菌的外源基因表達(dá)調(diào)控組件，大量的外源基因在這種細(xì)菌中可獲得高效表達(dá)，這為高產(chǎn)氨基酸的基因工程菌建構(gòu)創(chuàng)造了有利條件。與此同時(shí)，高產(chǎn)蘇氨酸的棒桿菌基因工程菌的建構(gòu)也獲得成功，產(chǎn)率達(dá)到 33 g/L以上。所以將氨基酸合成途徑的酶基因克隆到微生物中，可以產(chǎn)生更多的終產(chǎn)物。同時(shí)還可以對編碼這些酶的基因進(jìn)行突變，使它們不易受到終產(chǎn)物反饋抑制。 磷酸烯醇丙酮酸 赤蘚糖 4 磷酸DS3 脫氧 D 阿拉伯糖 庚酮糖酸 7 磷酸莽草酸分枝酸鄰 氨基苯甲酸ANS吲哚 3 磷酸甘油色氨酸吲哚絲氨酸苯丙氨酸酪氨酸PRT 350 圖 167 谷氨酸棒桿菌合成色氨酸的簡化途徑和調(diào)節(jié) DS、 ANS 和 PRT 分別表示 3脫氧 D阿拉伯糖 庚酮糖酸 7磷酸合成酶、鄰氨基苯甲酸合成酶和鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。吲哚在副反應(yīng)中產(chǎn)生，并在色氨酸合成酶作用下轉(zhuǎn)化為色氨酸 （ 2） L半胱氨酸高產(chǎn)菌的建構(gòu) L半胱氨酸是藥物、食品和化妝品工業(yè)中最重要的氨基酸之一，傳統(tǒng)方法是通過酸 水解人和動(dòng)物的毛發(fā)提取。將大腸桿菌絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列上 256位的蛋氨酸殘基逐一突變?yōu)槠渌?19種氨基酸，并將該突變 cysE基因轉(zhuǎn)化不降解 L半胱氨酸大腸桿菌，獲得 L半胱氨酸產(chǎn)量高的轉(zhuǎn)化子。