【正文】 轉(zhuǎn)移酶催化下，在線性載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾，而在目的基因的分子兩端加上dC多聚尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過(guò)DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。RM系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。甲基化是常見(jiàn)的修飾作用，可使腺嘌呤A 成為N6 甲基腺膘呤，胞嘧啶C 成為5‘ 甲基胞嘧啶。2. 說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶命名原則（舉例）。星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。(2)反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的RNA或DNA。(4)℃反應(yīng)，大約需4小時(shí)；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過(guò)夜。作cDNA克隆時(shí)，不會(huì)將RNA連接到DNA，不連接RNA。但在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，溫度過(guò)高，雖然酶反應(yīng)速度快，但是連接斷開(kāi)是雙向的，動(dòng)態(tài)平衡，可能由于熱運(yùn)動(dòng)的關(guān)系，斷開(kāi)速度也快，溫度過(guò)低，連接速度太慢。因此連接反應(yīng)常采用的最佳溫度一般在416℃間，通常多選用1216℃ 30分鐘到16小時(shí)。也稱為Klenow片段（Klenow frgment）， DNA聚合酶Ⅰ大片段（ DNA polymeraseⅠlargefragment）。② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③ 通過(guò)置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記④ 在cDNA克隆中合成第二鏈⑤ 隨機(jī)引物標(biāo)記⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性內(nèi)切酶？可劃為哪幾個(gè)類型？識(shí)別序列有結(jié)構(gòu)特點(diǎn)？限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能夠特異性識(shí)別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。、339。當(dāng)一個(gè)樣本DNA被一個(gè)特定的限制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同的堿基序列的DNA片段，進(jìn)而可以被用于基因重組、克隆、核酸分子雜交和序列分析等?？蓪?shí)現(xiàn)自主復(fù)制（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：質(zhì)粒分為嚴(yán)謹(jǐn)性和松弛型，因而拷貝數(shù)不同（3）質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒不能共存于同一個(gè)宿主細(xì)胞（4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：通過(guò)細(xì)菌的接合作用，質(zhì)粒可以被轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞中11. DNA聚合酶有哪些種類？各有什么活性？大腸桿菌DNA聚合酶I: 5‘3’ DNA 聚合酶活性 5‘339。539。539。539。 RNA外切核酸酶活性 339。RNA外切酶活性12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后，檢測(cè)目的基因是否表達(dá)的第一個(gè)步驟就是篩選。(2) 具有抗菌素抗性基因，便于篩選。(4) 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，便于制備。α互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷β半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的β半乳糖苷酶片段。3. 藍(lán)白斑篩選的原理大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β半乳糖苷酶。對(duì)于只編碼N端140 個(gè)氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ′) ，其產(chǎn)物也沒(méi)有酶學(xué)活性。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。4. 絲狀噬菌體載體克隆中經(jīng)常遇到哪些問(wèn)題？(1)較大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌體擴(kuò)增過(guò)程中往往不穩(wěn)定，很容易發(fā)生缺失的現(xiàn)象，這可能是由于感染較短的噬菌體比長(zhǎng)的噬菌體更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)所致。(3)重組中，經(jīng)常出現(xiàn)一些能以兩種可能方向插入的載體卻僅以一種特定方向插入外源DNA片段的情況，這是因?yàn)橥庠碊NA反向鏈的序列，在不同程度上干擾了載體基因間區(qū)域的功能所致。插入失活：通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。噬菌粒: 在質(zhì)粒中插入絲狀噬菌體的主要基因區(qū)域()，構(gòu)成一種特殊的質(zhì)粒載體，其基因區(qū)包括： 。？遺傳學(xué)特性：基因II基因突變，由G變?yōu)門。生物學(xué)功能：當(dāng)與噬菌粒載體共同存在于宿主細(xì)胞時(shí)M13KO7表達(dá)后的基因產(chǎn)物優(yōu)先作用于噬菌粒，使其進(jìn)行單鏈復(fù)制。黏粒：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ColE1）、抗性標(biāo)記（ampr）、cos位點(diǎn)。BAC：復(fù)制單元的特殊性:來(lái)自F質(zhì)粒，包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS，啟動(dòng)DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）以及3個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB和parC）。標(biāo)記基因:氯霉素抗性基因3. 黏粒載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)（1）同時(shí)具有λ噬菌體和質(zhì)粒載體的特性（2）具有高容量的克隆能力缺（1）兩個(gè)粘粒之間，當(dāng)存在同源序列時(shí)，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果使克隆的外源DNA片段重排或丟失。當(dāng)柯斯質(zhì)粒文庫(kù)復(fù)制擴(kuò)增時(shí)，由于不同的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞作用的情況不同，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)各種外源DNA片段間的比例失調(diào)。（3）包裝蛋白制備過(guò)程較復(fù)雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。5. 簡(jiǎn)述P1噬菌體載體的基本構(gòu)成元件。果聚糖蔗糖酶基因sacB，含sacB的大腸桿菌在蔗糖培養(yǎng)基上不能存活，用于插入失活篩選重組子。第五章1. 以大腸桿菌為例，表達(dá)載體比克隆載體多了哪些功能元件，各有什么生物學(xué)功能？⑴ 啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動(dòng)子部位啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。⑵ 終止子：轉(zhuǎn)錄會(huì)受到模板RNA序列結(jié)構(gòu)的影響，當(dāng)遇到頸環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)轉(zhuǎn)錄便會(huì)停止，或遇到ρ因子介導(dǎo)的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄也會(huì)停止。2. 簡(jiǎn)述表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則。（1）啟動(dòng)子選擇：以獲得最大限度的目的產(chǎn)物，則選擇高強(qiáng)啟動(dòng)子，在適當(dāng)條件下可使外源基因高水平表達(dá)，如大腸桿菌的Plac?？墒褂没蜃陨韱?dòng)子或宿主相關(guān)性狀基因的啟動(dòng)子。，使轉(zhuǎn)錄確有效終止。這類載體主要是質(zhì)粒載體。此類型的載體既可在大腸桿菌細(xì)胞和釀酒酵母細(xì)胞中復(fù)制，可實(shí)現(xiàn)在兩種不同的寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因，并單獨(dú)或同時(shí)在兩種宿主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它的調(diào)節(jié)功能。檢查真核基因密碼子偏好是否存在原核表達(dá)系統(tǒng)的稀有密碼子。（3）若單獨(dú)的蛋白無(wú)活性，考慮是否統(tǒng)一起到克服分子伴侶的基因（4）控制表達(dá)條件，盡量不要形成包涵體？（1）真核基因含有內(nèi)含子序列，原核細(xì)胞中無(wú)法切除內(nèi)含子，從而無(wú)法表達(dá)蛋白產(chǎn)物。（3）表達(dá)出的真核蛋白產(chǎn)物易被細(xì)菌的蛋白酶降解。？（1）由于RNA是單鏈，易受到核酸酶的攻擊，應(yīng)盡量避免RNA的降解。（3）防止機(jī)械剪切和高溫對(duì)RNA的傷害，剪切和高溫可能會(huì)導(dǎo)致降解。7. 簡(jiǎn)述PET表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)及工作原理特點(diǎn)：表達(dá)載體pET5a是典型的pET載體，含T7噬菌體啟動(dòng)子序列，當(dāng)外源基因插入其下游的幾個(gè)酶切位點(diǎn)后，就可在特定的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。（2）用于表達(dá)的宿主細(xì)胞必須能表達(dá)T7噬菌體的RNA聚合酶。（4）控制外源基因嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)的2個(gè)系統(tǒng) RNA聚合酶的量來(lái)實(shí)現(xiàn)的在宿主細(xì)胞中引入一個(gè)帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)粒，它們表達(dá)T7噬菌體的溶菌酶。也可利用T7lac啟動(dòng)子。只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，才能解開(kāi)T7 RNA聚合酶基因