【正文】 _____________________ ② 原理： __________ 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定 DNA片段 DNA復(fù)制 已知核苷酸序列的基因 四種脫氧核苷酸 一對(duì)引物 DNA聚合酶 （ Taq酶）一段已知目的基因的核苷酸序列 （ 2） 利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 引物： 20個(gè)左右堿基、根據(jù) 已知目的基因的核苷酸序列合成 的短 DNA單鏈 ④ 方式： 以 _____方式擴(kuò)增，即 ____（ n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)） ⑤ 結(jié)果： 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增 5/ 3/ G— G T— C 3/ 5/ A— G C— C 5/ 3/ 引物 Ⅱ G—G 變性 復(fù)性 延伸 5/ 3/ 引物 Ⅰ 第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的 DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）加熱至 90～ 95 ℃ ，使雙鏈 DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi)，變成單鏈 DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。 第三步：將反應(yīng)體系升溫至 70～ 75 ℃ ，在耐高溫的 DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的 3OH上，使 DNA鏈延伸 ,產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的 DNA鏈。 c、延伸（ 70℃ 75℃ ）：在 Taq酶的作用下，從引物的 5′端 → 3′端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的 ________。 PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在 PCR擴(kuò)增儀中完成的。 30輪循環(huán)可獲得 230（ 109)個(gè)基因片段 DNA復(fù)制與 PCR技術(shù)的比較 項(xiàng)目 DNA復(fù)制 PCR技術(shù) 場(chǎng)所 細(xì)胞核內(nèi) 生物體外 原理 堿基互補(bǔ)配對(duì) 堿基互補(bǔ)配對(duì) 酶 DNA聚合酶、解旋酶 熱穩(wěn)定 DNA聚合酶 （ Taq酶） 條件 模板、 ATP、引物鏈、常溫 模板、 ATP、引物鏈、溫 度變化（ 90℃ ～ 95℃ → 55℃ ～ 60℃ → 70℃ ～ 75℃ ) 原料 四種脫氧核苷酸 四種脫氧核苷酸 特點(diǎn) 形成的是整個(gè) DNA分子，一個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次 短時(shí)間內(nèi)形成大量目的基因 DNA片段 有人采用總 DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生 物中的總 DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法 導(dǎo)入受體植物， 沒(méi)有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建 ，這種方 法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定什么基因?qū)? 入了受體植物。 將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？ 如果這么做，結(jié)果會(huì)怎樣？ （二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ——核心 質(zhì)粒 DNA分子 限制酶處理 兩個(gè)切口 獲得目的基因 DNA連接酶 重組 DNA分子（重組質(zhì)粒） 同一種 一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的結(jié)果可能有幾種情況？ 目的基因與目的基因結(jié)合； 質(zhì)粒與質(zhì)粒結(jié)合； 目的基因與質(zhì)粒結(jié)合。植物學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，對(duì)目的基因作適當(dāng)?shù)男揎?，使得目的基因在棉花植株的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期都表達(dá)，以防止害蟲(chóng)侵害，這種對(duì)目的基因所作的修飾發(fā)生在（ ） A、內(nèi)含子 B、外顯子 C、編碼區(qū) D、非編碼區(qū) D ① 基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才比較有利于基因的表達(dá)。 （三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ? 常用的受體細(xì)胞： 動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物無(wú)感染能力。研究證明，主要酚類誘導(dǎo)物為 乙酰丁香酮 和 羧基乙酰丁香酮 ，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。 顯微注射技術(shù) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純(濃度 13%ug/mL) 取卵 顯微注射 人工受精 將受精卵移入子宮 顯微注射法 特點(diǎn) 不足 ? DNA損失少 。 ? 整合效率高 . ? 儀器設(shè)備要求高 。 感受態(tài)細(xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞： (A)常用的受體細(xì)胞： 大腸桿菌 (最廣泛 )、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌 (B)導(dǎo)入途徑： 受體細(xì)胞 (細(xì)菌 ) CaCl2處理 細(xì)菌細(xì)胞壁通透性增加 感受態(tài)細(xì)胞與 重組質(zhì)粒混合 感受態(tài)細(xì)胞吸 收重組質(zhì)粒 主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞方法 原因 ：繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)少。 思考：為什么要用 Ca2＋ 處理細(xì)胞？ （四）目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢測(cè) — ① 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 ② 檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA ③ 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) DNA分子雜交 DNARNA分子雜交 抗原 —抗體雜交 ? 如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。 Ｂ、對(duì)基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品進(jìn)行 活性比較 有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。 的內(nèi)容，正確的組合是 C 2. （ 2022T2）在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)程中，下列操作錯(cuò)誤的是 A。用 DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體 C。用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞 A ，獲得該基因的最佳方法是 A． 用 mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成 DNA B．以 4種脫氧核苷酸為原料人工合成 C．將供體 DNA片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，再進(jìn)一步篩選 D．由蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測(cè) mRNA B 現(xiàn)在只知道序列信息。 D已知 DNA堿基序列了，推測(cè) mRNA根本沒(méi)有意義。但是一個(gè)限制條件就是 DNA必須不能太長(zhǎng)。下列敘述不正確的是 A．基因中的啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控序列對(duì)于抗蟲(chóng)基因在棉花細(xì)胞中的表達(dá)是不可缺少 B．重組 DNA分子中增加一個(gè)堿基對(duì)，不一定導(dǎo)致毒蛋白的毒性喪失 C．抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)基因可通過(guò)花粉傳遞至近緣作物，從而造成基因污染 D．轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲(chóng)特性是通過(guò)檢測(cè)棉花對(duì)抗生素抗性來(lái)確定的 D ，通過(guò)花粉轉(zhuǎn)移到自然界中其他植物體內(nèi)，科學(xué)家設(shè)法將目的基因整合到受體細(xì)胞的葉綠體基因組中，其原因是 A．葉綠體基因組不會(huì)進(jìn)入到生殖細(xì)胞中 B．植物雜交的后代不會(huì)出現(xiàn)一定的性狀分離比 C．轉(zhuǎn)基因植物中的質(zhì)基因與其他植物間不能通過(guò)花粉發(fā)生基因交流 D．轉(zhuǎn)基因植物與其他植物間不能通過(guò)花粉發(fā)生基因交流 C ，正確的是 (雙選 )( ) 、植物或微生物 、 RNA聚合酶、 DNA連接酶是常用的工具酶 生物活性 DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá) C A (08山東 )35．為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。 （ 1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組 DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處， DNA連接酶作用于 處。 （ 3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)。 （ 4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)