基因工程復(fù)習(xí)總結(jié)-wenkub
2022-09-02 22:37:56 本頁面
【正文】 加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾，而在目的基因的分子兩端加上dC多聚尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。而染色體DNA較大，不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。(1)．基因及其產(chǎn)物的共線性 (2)．基因及其產(chǎn)物的非共線性(3)．基因的重疊與基因的可變性 (4)．啟動(dòng)子和終止子4. 重組DNA技術(shù)包括哪些步驟分分離制備目的基因切切割目的基因和載體接目的基因與載體連接轉(zhuǎn)將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩篩選并檢定含有重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆表克隆基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)5. 基因工程的流程目的基因的分離制備→與載體體外重組→遺傳轉(zhuǎn)化→轉(zhuǎn)化子篩選→提取目的基因→測序 ↓獲得優(yōu)良品種 ←表達(dá)特定蛋白產(chǎn)物←導(dǎo)入宿主細(xì)胞←將目的基因克隆到表達(dá)載體(1)限制性核酸內(nèi)切酶：在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割(2)DNA連接酶：將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體(3)DNA聚合酶I：通過向3’端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性(4) Klenow DNA聚合酶:是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。基因操作: 對基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱?；蚬こ?專指為實(shí)踐應(yīng)用而進(jìn)行的基因重組事件，產(chǎn)生的基因工程體可以用作生物反應(yīng)器，或改變了生物性狀的工程體等。(5)反轉(zhuǎn)錄酶:以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈(6)DNA末端轉(zhuǎn)移酶:將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端(7)堿性磷酸酶:去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團(tuán)(8)降解酶S1:降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時(shí)也可切割雙鏈核酸分子的單鏈(9)Taq DNA 聚合酶：能在高溫（72℃）下以單鏈DNA為模板，從5’→3’方向合成新的互補(bǔ)鏈。9. 常用的目的基因與載體的連接方法（1）黏性末端連接：將靶基因DNA片段和載體DNA經(jīng)過相同的限制酶進(jìn)行切割，使他們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端，然后經(jīng)黏性末端堿基配對和DNA連接酶的作用，共價(jià)連接成為新的重組DNA分子。第二章1. 什么是細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)，其功能是什么？細(xì)胞中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制—修飾系統(tǒng)(RMRestrictionmodification system)。修飾作用是通過甲基化酶來的甲基化作用，是宿主細(xì)胞能識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的機(jī)制。4. T4 DNA ligase ligase 有什么異同？同：(1)催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。不同： ligase需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。4度過夜也是有很高的連接效率。Klenow DNA聚合酶作用① 補(bǔ)平3′凹端，如果使用帶標(biāo)記的dNTP，則可對DNA進(jìn)行末端標(biāo)記。突出的黏性末端或平末端。 DNA外切核酸酶活性 339。 DNA外切酶活性T4 DNA聚合酶:3’5’DNA外切酶活性T7 DNA聚合酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。539。(3) 具若干限制酶單一識別位點(diǎn)，可以進(jìn)行特異性酶切。在lacZ ’ 編碼區(qū)上游插入一小段DNA 片段（如51 個(gè)堿基對的多克隆位點(diǎn)），不影響β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。lacZ△M15 基因是編碼缺失了β半乳糖苷酶中第1141 個(gè)氨基酸的lacZ 基因無酶學(xué)活性。若在該DNA 小片段中再插入一個(gè)大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無α互補(bǔ)能力的β半乳糖苷酶片段。(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中往往單雙鏈混雜，純化某種類型的分子(尤其是雙鏈分子)比較費(fèi)力，同時(shí)由于重組DNA容易產(chǎn)生缺失，培養(yǎng)時(shí)間不能長，故所得DNA的量有限。當(dāng)外源DNA 片段插入tetr 基因后，導(dǎo)致tetr 基tet tet 因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。(ori)，因此可像質(zhì)粒一樣擴(kuò)增。第四章1. 大容量克隆載體有哪些種類，各有何特點(diǎn)？黏粒載體（cosmid）；酵母人工染色體載體（YAC）；細(xì)菌人工染色體載體(BAC)； P1噬菌體載體(P1)；P1人工染色體載體(PAC)2. 簡述黏粒、YAC、BAC克隆載體基本構(gòu)成元件。低拷貝性可以減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒副作用。另外不同重組柯斯質(zhì)粒的產(chǎn)量相差懸殊。⑴ 復(fù)制元件：質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子⑵ 環(huán)化和包裝信號：2個(gè)loxP重組位點(diǎn)和包裝識別位點(diǎn)pac,用于體外包裝⑶ 標(biāo)記基因：kanr。當(dāng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)以后，RNA聚合酶對啟動(dòng)子下游要轉(zhuǎn)錄的序列是無法識別的，這就為利用強(qiáng)啟動(dòng)子來表達(dá)目的基因提供了可能。表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達(dá)所需的元件，當(dāng)外源基因被接入合適的位點(diǎn)后，在宿主中啟動(dòng)表達(dá)，因此表達(dá)載體的構(gòu)建原則主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。（2）轉(zhuǎn)錄有效性，以防止轉(zhuǎn)錄提前終止。大腸桿菌釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)與選擇標(biāo)記，另有一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)。稀有密碼子的地方會成為表達(dá)瓶頸，對其進(jìn)行點(diǎn)突變。（4）在原核細(xì)胞中，真核基因所表達(dá)出的蛋白往往不能進(jìn)行正常的折疊，而形成沒有活性的包涵體。（4）維持pH4—10，防止核酸在堿性條件下降解。（3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達(dá)載體的宿主菌，該菌對T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)行多層次的調(diào)控。在pET載體上裝載lacⅠ基因，提高阻抑物的濃度。工作原理：pET載體進(jìn)入大腸桿菌BL21（DE3）中后，由于宿主細(xì)胞的的lac I基因表達(dá)產(chǎn)生阻遏物，從而抑制T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)，在載體上的目的基因也無法表達(dá)，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)物加入時(shí)，使阻遏物失去抑制作用，T7 RNA聚合酶基因可以表達(dá)，從而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)。在體外采用變性、退火、延伸過程，以含有目的片段的DNA為模板，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，在DNA聚合酶作用下實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增。過程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于9296℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)（2）退火（annealing）：將溫度降至3772℃，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合（3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘OH端，合成DNA。3. PCR技術(shù)有哪些應(yīng)用？4. PCR引物有哪些基本要求？① 長度：至少16 bp，通常為1830 bp，更短的引物一般會降低擴(kuò)增的特異性，但會提高擴(kuò)增的有效性。⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC連排。應(yīng)用:
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