【文章內(nèi)容簡介】 位點pac,用于體外包裝⑶ 標記基因：kanr。果聚糖蔗糖酶基因sacB，含sacB的大腸桿菌在蔗糖培養(yǎng)基上不能存活，用于插入失活篩選重組子。⑷ 克隆位點： sacB內(nèi)部⑸ 填充片段：11kb腺病毒，作為填充物彌補外源DNA片段長度。第五章1. 以大腸桿菌為例，表達載體比克隆載體多了哪些功能元件，各有什么生物學功能？⑴ 啟動子：轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶在啟動子部位啟動RNA轉(zhuǎn)錄的過程。當轉(zhuǎn)錄啟動以后，RNA聚合酶對啟動子下游要轉(zhuǎn)錄的序列是無法識別的，這就為利用強啟動子來表達目的基因提供了可能。⑵ 終止子：轉(zhuǎn)錄會受到模板RNA序列結(jié)構(gòu)的影響，當遇到頸環(huán)結(jié)構(gòu)時轉(zhuǎn)錄便會停止，或遇到ρ因子介導的終止信號轉(zhuǎn)錄也會停止。⑶ 核糖體結(jié)合位點： 細胞中的核糖體必須在mRNA上找到有效的核糖體結(jié)合位點（RBS）以及其中的ShineDalgarno序列（SD序列），從而啟動鄰近其下游的翻譯起始密碼子的蛋白質(zhì)翻譯。2. 簡述表達載體構(gòu)建的一般原則。表達載體實際上是在克隆載體的基礎上增加了表達所需的元件，當外源基因被接入合適的位點后，在宿主中啟動表達，因此表達載體的構(gòu)建原則主要體現(xiàn)在表達元件的選擇和利用。（1）啟動子選擇：以獲得最大限度的目的產(chǎn)物，則選擇高強啟動子，在適當條件下可使外源基因高水平表達，如大腸桿菌的Plac。：使宿主表現(xiàn)出一種特殊性或啟動其他產(chǎn)物合成?？墒褂没蜃陨韱幼踊蛩拗飨嚓P(guān)性狀基因的啟動子。（2）轉(zhuǎn)錄有效性，以防止轉(zhuǎn)錄提前終止。，使轉(zhuǎn)錄確有效終止。（3）翻譯的有效性 3. 何為穿梭載體，在遺傳結(jié)構(gòu)上有何特點？穿梭載體（shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體，如有些載體既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中復制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。大腸桿菌釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復制起點與選擇標記，另有一個多克隆位點區(qū)。此類型的載體既可在大腸桿菌細胞和釀酒酵母細胞中復制，可實現(xiàn)在兩種不同的寄主細胞之間來回轉(zhuǎn)移基因，并單獨或同時在兩種宿主細胞中研究目的基因的表達活性及其它的調(diào)節(jié)功能。4. 將人的某個基因在大腸桿菌中表達應注意哪些問題？（1）序列為去掉內(nèi)含子的cDNA序列（2）要用原核啟動子。檢查真核基因密碼子偏好是否存在原核表達系統(tǒng)的稀有密碼子。稀有密碼子的地方會成為表達瓶頸，對其進行點突變。（3）若單獨的蛋白無活性，考慮是否統(tǒng)一起到克服分子伴侶的基因（4）控制表達條件，盡量不要形成包涵體？（1）真核基因含有內(nèi)含子序列，原核細胞中無法切除內(nèi)含子，從而無法表達蛋白產(chǎn)物。（2）細菌的RNA聚合酶無法識別真核啟動子。（3）表達出的真核蛋白產(chǎn)物易被細菌的蛋白酶降解。（4）在原核細胞中，真核基因所表達出的蛋白往往不能進行正常的折疊，而形成沒有活性的包涵體。？（1）由于RNA是單鏈，易受到核酸酶的攻擊，應盡量避免RNA的降解。（2）盡量簡化操作步驟，縮短時間。（3）防止機械剪切和高溫對RNA的傷害，剪切和高溫可能會導致降解。（4）維持pH4—10，防止核酸在堿性條件下降解。7. 簡述PET表達系統(tǒng)的特點及工作原理特點：表達載體pET5a是典型的pET載體，含T7噬菌體啟動子序列，當外源基因插入其下游的幾個酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。（1）T7噬菌體啟動子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識別并啟動轉(zhuǎn)錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動子。（2）用于表達的宿主細胞必須能表達T7噬菌體的RNA聚合酶。（3）大腸桿菌BL21（DE3）是常用的pET表達載體的宿主菌，該菌對T7 RNA聚合酶和目的基因的轉(zhuǎn)錄實行多層次的調(diào)控。（4）控制外源基因嚴謹表達的2個系統(tǒng) RNA聚合酶的量來實現(xiàn)的在宿主細胞中引入一個帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)粒，它們表達T7噬菌體的溶菌酶。該溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，從而減少在未誘導情況下外源基因的表達。在pET載體上裝載lacⅠ基因，提高阻抑物的濃度。也可利用T7lac啟動子。在當阻抑物結(jié)合在lacO位點時，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也無法表達。只有當誘導物存在時，才能解開T7 RNA聚合酶基因和外源基因表達的雙重阻遏。工作原理：pET載體進入大腸桿菌BL21（DE3）中后，由于宿主細胞的的lac I基因表達產(chǎn)生阻遏物，從而抑制T7 RNA聚合酶基因的表達，在載體上的目的基因也無法表達，當IPTG誘導物加入時，使阻遏物失去抑制作用，T7 RNA聚合酶基因可以表達，從而啟動T7啟動子控制外源基因的表達。（1）在表達載體上使用T7啟動子，在宿主細胞中表達T7 RNA聚合酶，構(gòu)成了表達系統(tǒng)。（2）T7啟動子的轉(zhuǎn)錄活性和宿主T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性均受IPTG的誘導、第八章1. 簡述PCR擴增的原理和過程？如果要擴增某基因，需要知道什么信息?原理：利用生物體內(nèi)DNA的半保留復制原理。在體外采用變性、退火、延伸過程，以含有目的片段的DNA為模板，根據(jù)目的基因序列設計引物，在DNA聚合酶作用下實現(xiàn)目的基因擴增。目的基因的基本信息：片段大小、序列和堿基特點等。據(jù)此來決定PCR策略。如果是已知序列，可設計引物，直接從含有目的基因序列的DNA中擴增；知道部分序列的，先PCR獲得該序列，再采用RACE或反向PCR等技術(shù)獲得全長序列。過程：（1）變性（denaturation）：將模板DNA置于9296℃，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學性質(zhì)（2）退火（annealing）：將溫度降至3772℃，使引物與模板的互補區(qū)相結(jié)合（3）延伸（extension）：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3‘OH端，合成DNA。這三個熱反應過程的重復稱為一個循環(huán)，經(jīng)過2040個循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的DNA片段。2. T/A克隆的基本原理是什么？Tap DNA聚合酶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3’末端添加一個核苷酸，通常為A。因此，Tap DNA聚合酶擴增的產(chǎn)物可與T載體進行黏端互補連接，達到高效克隆的目的。3. PCR技術(shù)有哪些應用？4. PCR引物有哪些基本要求？① 長度：至少16 bp，通常為1830 bp，更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性。② 解鏈溫度（Tm值）：兩個引物之間的Tm值差異最好在25℃。③ 避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基）④ G＋C含量盡量控制在40%60%之間，4種堿基的分布應盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及T在3′末端的重復排列。⑤ 引物的3′末端最好是G或C，但不要GC連排。第九章1. 簡述化學降解法測序的基本原理以及主要應用范圍。原理：將待測DNA片段的5‘端磷酸基團作放射性標記，再分別采用不同的化學方法對特定堿基進行化學修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列長度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點樣（lanebylane）的方式用凝膠電泳進行分離，