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正文內(nèi)容

基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(編輯修改稿)

2024-09-01 23:04 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 操作,回收DNA酶切產(chǎn)物。不同的試劑盒的操作原理相同,但步驟稍有差別,應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。例如:(1)上海生工 UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟: ①按400mL/100mg凝膠的比例加入Binding Buffer II,置于5060℃水浴中10min,每2min混勻一次,使膠徹底熔化。②將熔化的膠溶液移到套放在2mL收集管內(nèi)的UNIQ10柱中,室溫放置2min。③5000r/min室溫離心1min。取下UNIQ10柱,倒掉收集管中的廢液。④將UNIQ10柱放入同一個收集管中,加入500mL Wash Solution,5000r/min室溫離心1min。⑤重復(fù)上一步洗滌一次。⑥取下UNIQ10柱,倒掉收集管中的廢液,將UNIQ10柱放回到同一個收集管中,12000r/min室溫離心1min。⑦,在柱子膜中央加30mL Elution Buffer(或dd water,pH),室溫或37℃放置2min(5580℃洗脫效果更好)。⑧8000r/min室溫離心1min,離心管中的液體就是回收產(chǎn)物。(2)其它公司的試劑盒(如AXYGEN公司的AXYprep? DNA Gel Extraction Kit)的操作步驟與上述大同小異,做實(shí)驗(yàn)時按照各家的產(chǎn)品說明書操作即可。8. 可取2μl5μl回收產(chǎn)物電泳,檢測是否有回收到的目的DNA帶。9. 清理桌面,撰寫實(shí)驗(yàn)記錄。【思考題】1. 為何避免用EB染色及用紫外燈照射欲回收的目的DNA?實(shí)驗(yàn)六 目的基因片段與載體連接【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會DNA片斷的體外連接技術(shù)?!緦?shí)驗(yàn)原理】 在Mg2+和ATP存在下,T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。 【實(shí)驗(yàn)用品】1. 器材旋渦混合器,微量移液取樣器,雙面微量離心管架,臺式離心機(jī),干式恒溫氣浴,恒溫水浴,泡沫塑料保溫盒。 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅活。2.試劑(1) T4 DNA 連接酶(2) 連接酶緩沖液(3) 無菌dd Water等3.材料(1) pMD19T 載體。NK PCR產(chǎn)物(2) EcoRI +BamHI酶切回收的pETTrx載體。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片斷【實(shí)驗(yàn)方法】1. PCR產(chǎn)物與T載體直接連接: (1) 事先將干式恒溫儀(或泡沫塑料保溫盒里的水)溫度調(diào)整到14176。C。(2) ,加入:PCR 產(chǎn)物混合液 4mLpMD19T載體 1mLT4 DNA連接酶(TAKARA, 350U/ul) 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL (3) 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心,然后置于14176。C水中保溫過夜。(4) 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(方法見實(shí)驗(yàn)八)或置4176。C冰箱備用。2. DNA回收片斷(NK)與表達(dá)載體(pETTrx)連接:(1) ,加入:NK片段回收產(chǎn)物 4mLpETTrx載體酶切回收產(chǎn)物 1mLT4 DNA連接酶(TAKARA, 350U/uL) 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL(2) 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心,然后置于14176。C干式恒溫儀(或14176。C水中)中保溫過夜。(3) 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(方法見實(shí)驗(yàn)八)或置4176。C冰箱備用?!舅伎碱}】1. 連接酶的最適活性溫度是多少?2. 為什么要采用14176。C下連接?3. 如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量?實(shí)驗(yàn)七 感受態(tài)大腸桿菌的制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞?!緦?shí)驗(yàn)原理】 細(xì)菌在0176。C的 CaCl2低滲溶液中脹成球形,丟失部分膜蛋白,成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)?!緦?shí)驗(yàn)用品】1.器材旋渦混合器,微量移液取樣器,雙面微量離心管架,臺式冷凍離心機(jī),制冰機(jī),恒溫?fù)u床,分光光度計(jì),超凈工作臺,恒溫培養(yǎng)箱,接種環(huán)。搖菌試管、三角燒瓶、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。2.試劑(1) LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,加200mL dd water 攪拌完全溶解,用約200mL 5N ,加dd water至1L,121176。C 20min滅菌。(2) mol/L CaCl2溶液,121176。C 20min滅菌后存放在冰箱。(3) 無菌dd Water3.材料E. coli DH5a,E. coli BL21(DE3)【實(shí)驗(yàn)方法】1. 取一支無菌的搖菌試管,在超凈工作臺中加入2mL LB培養(yǎng)基(不含抗菌素?。?。2. 從超低溫冰柜中取出DH5a菌種和BL21(DE3)菌種,放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中,然后接入含2mL LB培養(yǎng)基的試管中,37℃搖床培養(yǎng)過夜。3. LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中,37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h。4. (~,細(xì)胞數(shù)108/mL,此為關(guān)鍵參數(shù)?。?。以下操作除離心外,都在超凈工作臺中進(jìn)行。如果有大型冷凍離心機(jī)則應(yīng)當(dāng)使用50mL離心管離心集菌和CaCl2處理。5. ,于冰上放置10min,然后于4℃,5000r/min離心10min。6. 棄上清,并將離心管倒置以倒盡上清液。加入1mL mol/L CaCl2溶液,立即在渦旋混合器上混勻,插入冰中放置30min。7. 4℃,5000r/min離心10min。棄上清液后,用1mL mol/L CaCl2溶液垂懸,插入冰中放置30min。8. 4℃,5000r/min離心10min。棄上清液后,用200μL mol/L CaCl2溶液垂懸。9. 分裝好的感受態(tài)菌可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(方法見實(shí)驗(yàn)八),或立即放入80℃超低溫冰柜中保藏(可存放數(shù)月)。以后用的時候每次用完一管,不可反復(fù)凍融。10. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實(shí)驗(yàn)記錄?!舅伎碱}】1. 制作感受太菌的過程中,應(yīng)注意那些關(guān)鍵步驟?2. CaCl2溶液的作用是什么?為什么要冰冷的?實(shí)驗(yàn)八 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】 質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面,經(jīng)過42176。C短時間的熱休克處理,促進(jìn)其吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá),就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中篩選。如果轉(zhuǎn)化成功,獲得外源質(zhì)粒的受體菌能夠依靠質(zhì)粒上的抗菌素抗性基因在選擇平板培養(yǎng)基上生長,沒有獲得外源質(zhì)粒的菌體將被抗菌素殺死?!緦?shí)驗(yàn)用品】1.器材旋渦混合器,微量移液取樣器,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī),恒溫?fù)u床,超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)皿、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。4.試劑(1) LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,加200mL dd water 攪拌完全溶解,用約200mL 5N ,加dd water至1L,121176。C 20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素,終濃度100mg/mL。(2) 氨芐青霉素儲存液:無菌水配制100mg/mL,20176。C保存。(3) LB平板培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂,高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100μg/mL,每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。(4) 無菌dd water(5) 20%(M/V)IPTG:無菌水配制,過濾滅菌。(6) 2%(M/V)Xgal:用N,N二甲基甲酰胺配制,過濾除菌,鋁箔封裹避光20176。C保存。3.材料 感受態(tài)細(xì)菌,質(zhì)?!緦?shí)驗(yàn)方法】1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。2. 從80℃ 超低溫冰柜中取出一管(50μL)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。3. 加入5μL連接好的質(zhì)?;旌弦海―NA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。5. 在超凈工作臺中向上述管中加入300μL LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩45min。6. 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液50~300μL(根據(jù)轉(zhuǎn)化效率和載體連接效率而定),滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中。從酒精中取出玻璃涂布棒,在火上點(diǎn)燃,熄滅后稍等片刻,待其冷卻后輕輕涂布均勻。7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μL 2% Xgal,7μL 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中約10~30min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約18h。9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實(shí)驗(yàn)記錄。10. 觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。挑選白色菌斑進(jìn)行篩選和鑒定(方法見實(shí)驗(yàn)九)。【思考題】1. 影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些?2. 白色菌落出現(xiàn)的原理是什么?實(shí)驗(yàn)九 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌?!緦?shí)驗(yàn)原理】 利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。選擇一定數(shù)目的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,用載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切,如果切出預(yù)期的DNA片段,說明質(zhì)粒上插入了外源DNA片段。也可以以提取的質(zhì)粒為模板,或直接以選擇培養(yǎng)基上的菌落得少量菌體為模板,用目的DNA片段兩側(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果擴(kuò)增出預(yù)期的DNA帶,說明質(zhì)粒上插入了目的DNA?!緦?shí)驗(yàn)用品】1.器材旋渦混合器,小鑷子,微量移液取樣器,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī),PCR儀,恒溫?fù)u床,超凈工作臺,酒精燈。牙簽、搖菌管、。2.試劑(1) LB培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,加200mL dd water 攪拌完全溶解,用約200mL 5N ,加dd water至1L,121176。C 20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素,終濃度100mg/mL。(2) 氨芐青霉素儲存液:無菌水配制100mg/mL,20176。C保存。(3) LB平板培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂,高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100μg/mL,每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。(4) 無菌dd water(5) 20(M/V)%IPTG:無菌水配制,過濾滅菌。(6) 2%(M/V)Xgal:用N,N二甲基甲酰胺配制,過濾滅菌。(7) 50180。TAE電泳緩沖液():Tris堿 242g, Na2EDTA2H2O,dd water 定容至1L。使用時稀釋成1180。(8) 1000180。溴化乙錠儲存液():50mg溴化乙錠溶于100mL dd water,4176。C避光儲存。使用時在蒸餾水里滴入適量,使水看起來微微發(fā)紅即可。(9) 10180。加樣緩沖液:20% Ficoll 400,% SDS,%溴酚藍(lán)(10) 6180。加樣緩沖液:%溴酚藍(lán),40%蔗糖水溶液(11) DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):lDNA HindIII,Tiangen公司的Marker II或Marker III等。 (12) 電泳級瓊脂糖粉(13) 3U/μL Taq DNA聚合酶(14) 10PCR緩沖液(MgCl2 free)(15) 25mM MgCl2(16) dNTP混合液(每種25mM)(17) 無菌dd water(18) 溶液 I [葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液]:50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris HCl ,10mmol/L EDTA (19) 溶液 II(NaOH/SDS溶液):,1% SDS,現(xiàn)用現(xiàn)配(20) 溶液 III [KAc溶液()]:60mL 5mol/L KAc,補(bǔ)dd water至100mL(21) 10mg/mL RNase A:RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl ,15mmol/L NaCl中(22) TE 緩沖液:10mmol/L Tris HCl ,1mmol/L EDTA (23) 95%和70%乙醇(24) EcoR I和BamH I內(nèi)切酶,10內(nèi)切酶緩沖液(25) 65%甘油:65%甘油,3.材料 要鑒定的克隆,引物【實(shí)驗(yàn)方法】方法一:菌落快速PCR篩選法(選做)1. 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取3個邊緣清晰的白色菌落,并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標(biāo)記編號。2. PCR 微量離心管中配制25μL反應(yīng)體系(方法參見實(shí)驗(yàn)四)。 dd water
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