【文章內(nèi)容簡介】 操作，回收DNA酶切產(chǎn)物。不同的試劑盒的操作原理相同，但步驟稍有差別，應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。例如：（1）上海生工 UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟： ①按400mL/100mg凝膠的比例加入Binding Buffer II，置于5060℃水浴中10min，每2min混勻一次，使膠徹底熔化。②將熔化的膠溶液移到套放在2mL收集管內(nèi)的UNIQ10柱中，室溫放置2min。③5000r/min室溫離心1min。取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液。④將UNIQ10柱放入同一個收集管中，加入500mL Wash Solution，5000r/min室溫離心1min。⑤重復(fù)上一步洗滌一次。⑥取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回到同一個收集管中，12000r/min室溫離心1min。⑦，在柱子膜中央加30mL Elution Buffer（或dd water，pH），室溫或37℃放置2min（5580℃洗脫效果更好）。⑧8000r/min室溫離心1min，離心管中的液體就是回收產(chǎn)物。（2）其它公司的試劑盒（如AXYGEN公司的AXYprep? DNA Gel Extraction Kit）的操作步驟與上述大同小異，做實(shí)驗(yàn)時按照各家的產(chǎn)品說明書操作即可。8. 可取2μl5μl回收產(chǎn)物電泳，檢測是否有回收到的目的DNA帶。9. 清理桌面，撰寫實(shí)驗(yàn)記錄。【思考題】1. 為何避免用EB染色及用紫外燈照射欲回收的目的DNA？實(shí)驗(yàn)六 目的基因片段與載體連接【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會DNA片斷的體外連接技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】 在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。 【實(shí)驗(yàn)用品】1. 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式離心機(jī)，干式恒溫氣浴，恒溫水浴，泡沫塑料保溫盒。 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅活。2．試劑（1） T4 DNA 連接酶（2） 連接酶緩沖液（3） 無菌dd Water等3．材料（1） pMD19T 載體。NK PCR產(chǎn)物（2） EcoRI +BamHI酶切回收的pETTrx載體。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片斷【實(shí)驗(yàn)方法】1. PCR產(chǎn)物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或泡沫塑料保溫盒里的水）溫度調(diào)整到14176。C。（2） ，加入：PCR 產(chǎn)物混合液 4mLpMD19T載體 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul） 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL （3） 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14176。C水中保溫過夜。（4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（方法見實(shí)驗(yàn)八）或置4176。C冰箱備用。2. DNA回收片斷（NK）與表達(dá)載體（pETTrx）連接：（1） ，加入：NK片段回收產(chǎn)物 4mLpETTrx載體酶切回收產(chǎn)物 1mLT4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/uL） 連接酶緩沖液 1mLdd Water mL總體積 10mL（2） 將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14176。C干式恒溫儀（或14176。C水中）中保溫過夜。（3） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（方法見實(shí)驗(yàn)八）或置4176。C冰箱備用?！舅伎碱}】1. 連接酶的最適活性溫度是多少？2. 為什么要采用14176。C下連接？3. 如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？實(shí)驗(yàn)七 感受態(tài)大腸桿菌的制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞?！緦?shí)驗(yàn)原理】 細(xì)菌在0176。C的 CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，接種環(huán)。搖菌試管、三角燒瓶、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。2．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。C 20min滅菌。（2） mol/L CaCl2溶液，121176。C 20min滅菌后存放在冰箱。（3） 無菌dd Water3．材料E. coli DH5a，E. coli BL21（DE3）【實(shí)驗(yàn)方法】1. 取一支無菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2mL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素?。?。2. 從超低溫冰柜中取出DH5a菌種和BL21(DE3)菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含2mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。3. LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h。4. （~，細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)?。?。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進(jìn)行。如果有大型冷凍離心機(jī)則應(yīng)當(dāng)使用50mL離心管離心集菌和CaCl2處理。5. ，于冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min離心10min。6. 棄上清，并將離心管倒置以倒盡上清液。加入1mL mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。7. 4℃，5000r/min離心10min。棄上清液后，用1mL mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。8. 4℃，5000r/min離心10min。棄上清液后，用200μL mol/L CaCl2溶液垂懸。9. 分裝好的感受態(tài)菌可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（方法見實(shí)驗(yàn)八），或立即放入80℃超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。以后用的時候每次用完一管，不可反復(fù)凍融。10. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗(yàn)記錄?！舅伎碱}】1. 制作感受太菌的過程中，應(yīng)注意那些關(guān)鍵步驟？2. CaCl2溶液的作用是什么？為什么要冰冷的？實(shí)驗(yàn)八 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的基本操作技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】 質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42176。C短時間的熱休克處理，促進(jìn)其吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中篩選。如果轉(zhuǎn)化成功，獲得外源質(zhì)粒的受體菌能夠依靠質(zhì)粒上的抗菌素抗性基因在選擇平板培養(yǎng)基上生長，沒有獲得外源質(zhì)粒的菌體將被抗菌素殺死?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)皿、 微量離心管分別進(jìn)行高壓滅菌。4．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。C 20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2） 氨芐青霉素儲存液：無菌水配制100mg/mL，20176。C保存。（3） LB平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂，高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100μg/mL，每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。（4） 無菌dd water（5） 20%（M/V）IPTG：無菌水配制，過濾滅菌。（6） 2%（M/V）Xgal：用N,N二甲基甲酰胺配制，過濾除菌，鋁箔封裹避光20176。C保存。3．材料 感受態(tài)細(xì)菌，質(zhì)?！緦?shí)驗(yàn)方法】1. 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。2. 從80℃ 超低溫冰柜中取出一管（50μL）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。3. 加入5μL連接好的質(zhì)?；旌弦海―NA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。5. 在超凈工作臺中向上述管中加入300μL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩45min。6. 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液50~300μL（根據(jù)轉(zhuǎn)化效率和載體連接效率而定），滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中。從酒精中取出玻璃涂布棒，在火上點(diǎn)燃，熄滅后稍等片刻，待其冷卻后輕輕涂布均勻。7. 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μL 2% Xgal，7μL 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。8. 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中約10～30min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約18h。9. 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗(yàn)記錄。10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。挑選白色菌斑進(jìn)行篩選和鑒定（方法見實(shí)驗(yàn)九）。【思考題】1. 影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？2. 白色菌落出現(xiàn)的原理是什么？實(shí)驗(yàn)九 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)會用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌?！緦?shí)驗(yàn)原理】 利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。選擇一定數(shù)目的菌落接種培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，如果切出預(yù)期的DNA片段，說明質(zhì)粒上插入了外源DNA片段。也可以以提取的質(zhì)粒為模板，或直接以選擇培養(yǎng)基上的菌落得少量菌體為模板，用目的DNA片段兩側(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出預(yù)期的DNA帶，說明質(zhì)粒上插入了目的DNA?！緦?shí)驗(yàn)用品】1．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī)，PCR儀，恒溫?fù)u床，超凈工作臺，酒精燈。牙簽、搖菌管、。2．試劑（1） LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 攪拌完全溶解，用約200mL 5N ，加dd water至1L，121176。C 20min滅菌。使用時可加入氨芐青霉素，終濃度100mg/mL。（2） 氨芐青霉素儲存液：無菌水配制100mg/mL，20176。C保存。（3） LB平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中含14%瓊脂，高壓滅菌后加入氨芐青霉素至100μg/mL，每個培養(yǎng)皿中約15mL倒制平板。（4） 無菌dd water（5） 20（M/V）%IPTG：無菌水配制，過濾滅菌。（6） 2%（M/V）Xgal：用N,N二甲基甲酰胺配制，過濾滅菌。（7） 50180。TAE電泳緩沖液（）：Tris堿 242g， Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用時稀釋成1180。（8） 1000180。溴化乙錠儲存液（）：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4176。C避光儲存。使用時在蒸餾水里滴入適量，使水看起來微微發(fā)紅即可。（9） 10180。加樣緩沖液：20% Ficoll 400，% SDS，%溴酚藍(lán)（10） 6180。加樣緩沖液：%溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液（11） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。 （12） 電泳級瓊脂糖粉（13） 3U/μL Taq DNA聚合酶（14） 10PCR緩沖液（MgCl2 free）（15） 25mM MgCl2（16） dNTP混合液（每種25mM）（17） 無菌dd water（18） 溶液 I [葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液]：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl ，10mmol/L EDTA （19） 溶液 II（NaOH/SDS溶液)：，1% SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配（20） 溶液 III [KAc溶液（）]：60mL 5mol/L KAc，補(bǔ)dd water至100mL（21） 10mg/mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl ，15mmol/L NaCl中（22） TE 緩沖液：10mmol/L Tris HCl ，1mmol/L EDTA （23） 95%和70%乙醇（24） EcoR I和BamH I內(nèi)切酶，10內(nèi)切酶緩沖液（25） 65%甘油：65%甘油，3．材料 要鑒定的克隆，引物【實(shí)驗(yàn)方法】方法一：菌落快速PCR篩選法（選做）1. 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取3個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標(biāo)記編號。2. PCR 微量離心管中配制25μL反應(yīng)體系（方法參見實(shí)驗(yàn)四）。 dd water