【正文】 列（3個堿基）④ G＋C含量盡量控制在40%60%之間，4種堿基的分布應盡可能均勻。據(jù)此來決定PCR策略。在當阻抑物結合在lacO位點時，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也無法表達。（1）T7噬菌體啟動子只能由T7噬菌體的RNA聚合酶識別并啟動轉錄，而大腸桿菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌體啟動子。（2）細菌的RNA聚合酶無法識別真核啟動子。（3）翻譯的有效性 3. 何為穿梭載體，在遺傳結構上有何特點？穿梭載體（shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體，如有些載體既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中復制。⑶ 核糖體結合位點： 細胞中的核糖體必須在mRNA上找到有效的核糖體結合位點（RBS）以及其中的ShineDalgarno序列（SD序列），從而啟動鄰近其下游的翻譯起始密碼子的蛋白質翻譯。而且，購買包裝蛋白的費用較高。YAC：自主復制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere, CEN）和兩個端粒（TEL）。琥珀突變：在基因的編碼區(qū)中，若某個密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)閁AA），或琥珀突變（突變?yōu)閁AG），或乳白突變（突變?yōu)閁GA）。在相應的載體系統(tǒng)中，lacZ△M15 放在F 質粒上,隨宿主傳代； lacZ ’放在載體上, 作為篩選標記。利用這一互補性質，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質粒。方法：（1）抗藥性標記及其插入失活選擇法 （2）b半乳糖苷酶顯色反應選擇法 第三章1. 作為一個最基本的載體，它必須具備哪些功能元件？ (1) 具有復制起點，可在宿主細胞中進行獨立復制。 DNA外切酶活性Klenow酶:5‘3’ DNA 聚合酶活性 339。限制酶的識別和切割位點序列的長度一般為48個堿基，最常見的為6個堿基，且具有回文序列的DNA片段，主要產生539。5. 連接酶的反應溫度如何選擇，為什么？連接酶最適的反應溫度應是37℃。3. 限制內切核酸酶的星活性是指什么？星星活性（star activity）:在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。（3）人工接頭法：利用人工接頭加在平端的DNA片段的兩端，然后用相應的限制酶切割人工接頭以產生黏性末端，再與帶有相同黏性末端的載體進行連接。2. 為什么說基因工程是生物學和遺傳學發(fā)展的必然產物？（1）基因的提出與基因和DNA關系的建立，為基因重組打下物質基礎（2）DNA結構的闡明和DNA在生命活動中作用的認識，為基因操作打下了理論基礎（3）基因操作技術的發(fā)展直接導致基因工程的誕生和發(fā)展（4）人們研究的熱情和對基因工程產品的迫切需求，進一步推動了基因工程的快速發(fā)展3. 簡述基因的結構組成對基因操作的影響?；蚬こ蹋ɑ虿僮鳎褐饕抢肈NA 重組技術，將生物的某個基因或一個DNA片段通過基因載體（DNA載體）運送到另一生物的活性細胞中，然后經過克?。╟lone）和行使正常功能（表達），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學分子技術（從細菌到高等生物）。（2）平頭末端連接:將平末端的DNA分子在T4連接酶的作用下，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵相互連接。2. 說明限制性內切核酸酶命名原則（舉例）。作cDNA克隆時，不會將RNA連接到DNA，不連接RNA。② 抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③ 通過置換反應對DNA進行末端標記④ 在cDNA克隆中合成第二鏈⑤ 隨機引物標記⑥ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性內切酶？可劃為哪幾個類型？識別序列有結構特點？限制性核酸內切酶是由細菌產生的一類能夠特異性識別雙鏈DNA的特定堿基序列，并且能在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內切酶。539。RNA外切酶活性12. 什么是重組子篩選？有哪些方法？重組DNA導入受體細胞后，檢測目的基因是否表達的第一個步驟就是篩選。若在該DNA 小片段中再插入一個大片段，導致產生無α互補能力的β半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質粒。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。黏粒：質粒復制起點（ColE1）、抗性標記（ampr）、cos位點。（3）包裝蛋白制備過程較復雜，每批包裝蛋白的包裝效率不穩(wěn)定。⑵ 終止子：轉錄會受到模板RNA序列結構的影響，當遇到頸環(huán)結構時轉錄便會停止，或遇到ρ因子介導的終止信號轉錄也會停止。，使轉錄確有效終止。（3）若單獨的蛋白無活性，考慮是否統(tǒng)一起到克服分子伴侶的基因（4）控制表達條件，盡量不要形成包涵體？（1）真核基因含有內含子序列，原核細胞中無法切除內含子，從而無法表達蛋白產物。7. 簡述PET表達系統(tǒng)的特點及工作原理特點：表達載體pET5a是典型的pET載體，含T7噬菌體啟動子序列，當外源基因插入其下游的幾個酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。也可利用T7lac啟動子。目的基因的基本信息：片段大小、序列和堿基特點等。② 解鏈溫度（Tm值）：兩個引物之間的Tm值差異最好在25℃?；瘜W降解測序法特別適用于測定含有如5甲基腺嘌呤、G＋C含量較高的DNA片段以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。 M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構建cDNA文庫或BAC和PAC亞克隆文庫。⑸ 亞基因組文庫亞基因組文庫是相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段（如一個YAC或BAC克隆等）。第十三章1. 植物基因轉化受體系統(tǒng)具備的條件？（1）較高的遺傳穩(wěn)定性 （2）具有穩(wěn)定的外植體來源（3）對選擇抗生素敏感 （4）對農桿菌有敏感性（5）是否具有經濟價值或有潛在的生產應用價值2. 植物基因工程常用的受體系統(tǒng)有哪些？(1)愈傷組織再生系統(tǒng)(2)直接分化再生系統(tǒng)(3)原生質體再生系統(tǒng)(4)生殖細胞受體系統(tǒng)3. 植物基因轉化方法有哪些？(1)原生質體介導法: PEG介導的基因轉化，脂質體介導基因轉化，電激法介導基因轉化，顯微注射介導的基因轉化，激光微束介導的基因轉化(2)基因槍法(3)根癌農桿菌介導法4. 農桿菌轉化的基本原理及分子機理？在根癌農桿菌內有一個大的致瘤質粒（tumor inducing plasmid），簡稱Ti質粒。其次，二元載體的外源基因的轉化效率要高于一元載體。胚胎干細胞介導法是將外源基因導入胚胎干細胞，然后將轉基因的胚胎干細胞注射入受體動物胚胎后，可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。⑷ 胚胎移植胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依據(jù)早期胚胎的發(fā)育階段和物種的不同決定移植的部位。第十五章1. 舉例說明酵母基因工程相對于大腸桿菌基因工程的優(yōu)勢與不足